质谱用于河水、污水中的雌性激素化合物的检测

引言

　　近几年来，雌性激素对水环境中影响越来越大，因为这些化合物在浓度低至0.1 gn/L 时，都会导致雄性鱼的雌雄间性的变化。所以，需要一种具有灵敏度和选择性高的分析方法用于复杂样品中的雌性激素化合物的检测。

　　三类化合物被确定为会导致内分泌干扰的化合物，即天然产生的雌酮（E1），雌二醇（E2），和第三类合成雌激素－乙炔基雌二醇（EE2），它具有最高的内分泌干扰作用。它们的结果参见图1。

　　按照传统的分析方法，这些化合物都是在与如七氟丁酸酐，五氟丙酸及许多硅烷化试剂衍生化之后，用GC/MS 或GC/MS/MS 检测的。这种方法样品前处理非常复杂，增加了样品制备的时间。

　　使用液质联用技术分析雌激素，是不需要衍生化的。然而，单四极杆液质技术在分析复杂基体样品中如此低含量的雌激素时，其选择性会有所限制。近来，飞行时间质谱（TOF）技术的发展大大提高了TOF 的质量分辨率，一般在250－300 amu 范围内，可以达到0.04 amu 的精确度。这个范围适用于雌激素而且分辨率比四极杆质谱高至少一个数量级。更高的质量分辨率意味着降低样品或基质中非目标化合物的干扰。质量精度的提高可以得到化合物的精确质量数，因而得到更高的分析选择性[1,2]。

　　本文介绍了三种雌激素的检测方法，包括样品的保护、提取，净化和用大气压光离子化－液相/飞行时间质谱仪分析的所有步骤。其检测限（LOD）小于0.1 ng/L 以及对于实际样品的相对标准偏差（RSD）小于15%，回收率高于90%。

样品制备

　　在早期工作中，如果开发广泛而实用的分析方法，样品稳定性是一个必须考虑的因素之一。稳定性实验发现，保护剂可以满足要求。

　　样品制备中应先加入保护剂，然后经过三个制备步骤。所有的样品制备都是全自动的，几乎不需要操作者介入。

　　第一步是固相萃取浓缩的步骤。在这一步，800 毫升水样浓缩至4 毫升。

　　第二步是用正相色谱梯度洗脱，然后自动收集相应的馏分。制备液相采用Agilent 1100 制备液相系统，包括二元泵、控温多孔板自动进样器、柱温箱、可变波长检测器和控温馏分收集器。

　　第三步是采用体积排阻色谱（SEC），然后自动收集相应的馏分。

样品保护

　　本应用文献中的样品保护方法是在1 升样品中加入0.25 克硝酸铜和1 毫升浓盐酸。样品被储存于5℃的条件下（参见表2）。

样品制备第一步

　　固相萃取柱（Baker）是添有200 毫克SDB1，体积是3 毫升。所有的步骤都是在Zymark AutoTrace 系统上全自动进行的。

　　每一个萃取柱序列用5 毫升乙酸乙酯，3 毫升甲醇和3 毫升色谱纯的水活化。

　　1. 800 毫升样品加入内标，然后以10 mL/min 的流速通过已近活化的固相萃取柱。污水样品先用去离子水稀释5 倍（即200 毫升稀释至1000 毫升），然后加入内标。

　　2. 每一个固相萃取柱用3 毫升60% 甲醇，然后用3 毫升色谱纯的水序列清洗。

　　3. 固相萃取柱用空气干燥40 分钟。

　　4. 2×1.5 毫升乙酸乙酯加入经空气干燥的每个固相萃取柱。收集洗脱液，最后再加入1 毫升乙酸乙酯。

样品制备第二步

　　在这个步骤，采用正相色谱（NPC）和馏分收集。样品萃取液在45℃下用氮气吹干，大约吹30－45 分钟。然后溶解于0.25 毫升的环己烷：异丙醇（95:5）的溶液中，然后再用第三步进一步净化。

样品制备第三步

　　在本步骤中，将采用体积排阻色谱（SEC）和馏分收集。从第二步来的样品吹干（45℃），残留物再用0.25 ml的二氯甲烷溶解，然后用下列的条件净化：

　　收集的馏分经氮气吹干（45℃），残留物再用0.2 毫升的甲醇:水（10:90）溶解。最后，准备用液质分析。

定性分析

　　所有的分析都是在安捷伦的液相色谱/飞行时间系统上进行的。液相色谱/质谱包括安装大气压光离子源及Agilent 1100 液相色谱仪，以反相模式分析。1100 液相色谱由微量真空脱气机，二元泵，柱温箱，多孔板自动进样器。另外一个单元泵用于输入参比离子的导入。

结果和讨论

校正标准溶液的制备

　　2 ng/L 标样的典型色谱图参见图2。对于800 pg 的柱上进样量，其信/噪比在200 到400 之间。检测限约为20－40 pg 之间。

　　在这个反相色谱图中，三个目标化合物全部是基线分离。

　　采用内标化合物进行标准校正曲线的建立。三个内标分别为氘代4 雌酮，氘代5 雌二醇和氘代4 乙炔基雌二醇。内标的准确质量数分别为273.1798，276.2017和299.1954。

　　利用四点建立校正曲线，浓度分别为0，0.008，0.04和0.10 mg/L，所有标准溶液都含有浓度为0.02 mg/L的内标。校正标样最后相当于0，2，10，25 ng/L，内标标样的浓度为5 ng/L。

雌酮的校正曲线见图3。

稳定性数据

　　对于获得高质量的数据的基本要求是要保证雌激素在样品基质中保证稳定。若没有样品保护剂，化合物可能会快速降解，尤其在废水中。结果参见表1。

　　从表1 的结果可以看出，在没有加入保护剂时，两天之后，雌激素有明显的降解，雌酮和雌二醇降解最明显，冷藏会降低化合物降解的速度。在有保护剂的条件下，化合物的常温降解速度大大减慢，加上冷藏时，在15 天内，只有低于10% 的雌激素降解。数据结果参见表2。

　　图4-9 所示为提取离子流色谱图的例子。

回收率和精密度数据（%RSD）

　　用11 批次的样品进行分析方法的验证。样品包括添加0.1，2.0 或20.0 ng/L 的去离子水，河水，另外添加2.0 或20.0 ng/L的河水，最后流出废液样品，和另外添加2.5 或15 ng/L 最后流出废液样品，污水和添加25 ng/L的污水样品，详细地参见表3。

样品背景水平

检出限（LOD）和定量限（LOQ）

　　检出限（LOD）：整个样品的标准偏差× 4.65
　　定量限（LOQ）：精密度× 2 + 偏差（Bias）

精确质量数测定和质谱图测定

　　可以通过测量各种基质样品中的雌激素的精确质量数来得到方法的选择性。将测量的质量数或绝对偏差与理论值比较。偏差越小，可信度越高。质量偏差受样品基体背景及共流出峰的影响。对于测定的三个雌激素，10 ppm 相当于0.003 质量单位的误差。在负离子模式下，测定的三个雌激素的精确质量数如下：

　　表5 所示为在各种基质样品中，测定的三个雌激素的质量误差。数据是来自方法验证的那批样品的数据。

结论

　　方法的目的是得到每一个雌激素的定量限（LOQ）。所有的结果总结于表4 中。对于各个雌激素的定量限，乙炔基雌二醇，好于0.03 ng/L，雌二醇，好于0.3 ng/L和雌酮，好于1 ng/L。

　　回收率在89.4－108.9% 之间，对于河水和最后流出物的精密度优于15% RSD。对于测量的质量数精度，除了两个污水样品之外，所有的数据的质量精度均小于5 ppm， 所以结果具有很高的可信度。总的来说，此分析方法具有高灵敏度，高选择性的优点。