Eclipse Plus C18 柱和pH 选择性在含氨基药物分析中的作用

引言

　　在制药行业中，经常用反相HPLC分析含氮化合物。生物碱衍生物、抗生素，以及许多生源物质都具有药理活性。将一个新药推向市场非常昂贵，但也非常有意义。制药行业的竞争要求从药物发现到最终产品的QA/QC的各个阶段都提高效率。HPLC是药物开发的每个阶段中分离和鉴定潜在药物、药物降解产物、杂质、代谢物和其它相关化合物的关键工具。正确选择HPLC柱直接关系着实验室的效率，在很大程度上能缩短新药上市的时间。

　　在本研究中，我们对三种含氨基药物的市售剂型+2 个片剂和一个软膏+ 进行了HPLC 分析，证明Eclipse Plus C18 柱是方法开发（如，在药物开发的QA/QC阶段）的首选色谱柱。改变流动相pH对改变感兴趣峰与其它峰的选择性和分离度非常有用，但pH也可能影响峰形。许多色谱柱在pH 3 以上都会有活性（离子化）硅醇基。正是这些硅醇基可能与分析
物发生相互作用。pH 决定着化合物，特别是含氨基类化合物的离子化程度，同时也决定着它们与HPLC柱上离子化的硅醇基之间相互作用的程度。许多色谱柱在中性pH下对弱碱和弱酸的分离都出现拖尾现象。但Eclipse Plus C18 柱却能在pH 2.7 到7 范围内对氨基化合物的分离呈现良好峰形。这一点使Eclipse　Plus C18 柱成为选择性实验和方法优化的首选柱。

实验部分

　　三台Agilent 1200 系列液相色谱仪均包括二元泵、自动进样器、柱温箱和带半微量流通池的二极管阵列检测器，除流动相外都设置了相同的方法：
　　系统1 A：0.1% 甲酸(v/v) pH 2.7
　　　　　B：乙腈含0.1% 甲酸0.1% (v/v)
　　系统2 A：20 mM醋酸钠pH 4.8
　　　　　B：乙腈
　　系统3 A：20 mM磷酸钠
　　　　　pH 7.0
　　　　　B：乙腈

　　这三个系统所用的梯度程序相同，10分钟内以1 mL/min的流速从10 到100% B。在254 nm 和230 nm 进行UV检测。分析柱采用的是ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 x 150 mm，5 μm，柱温40℃。

　　本文所分析的含氨基药物是盐酸吡格列酮片(Actos，Takeda Pharmaceuticals)、双嘧达莫片(Persantine，Boehringer Ingelheim Pharmaceticals)和利多卡因软膏(E. Fougera & Co.)。将样品制备成100 mg/mL活性成分的溶液。两种片剂的样品制备是将片剂用研钵研碎，转移到试管中，加甲醇，超声10 分钟。提取溶液用0.45 mm PFTE 注射式过滤器滤至三个自动进样器样品瓶中，后进行LC 分析。利多卡因的制备过程与之相似，将称量后的软膏至于试管中，用甲醇超声，过滤到自动进样器样品瓶中。化学结构和pKa值见表1。

结果与讨论

　　含氮药物经常被归为弱酸或弱碱，因为它们在水溶液中发生部分离解。离子化的程度取决于水溶液的pH值和该化合物的pKa 值。Henderson-Hasselbach 方程描述了它们之间的关系：

　　pH = pKa + log [A-] / [HA]

　　在这里，pH是氢离子浓度的负对数，pKa是50% A-和50% HA 时的pH（通常称为电离常数），[A-]和[HA]分别是共轭酸碱的浓度。

　　应当避免使流动相的的pH等于pKa，因为分子互换形式等量存在将导致峰展宽。当pH 值与pKa 相差一个单位时，分子的95%以一种形式存在，5%以另一种形式存在。当pH相差两个单位时，该比例变成了99:1。最好在与pKa 相差两个pH 单位的条件下进行分析。另外，氨基(NH+)与硅胶基质离解的硅醇基(SiO-)之间发生相互作用(在pH 3-7 之间)，这是第二种保留机制，以及对峰拖尾的影响因素。基于这些原因，使用低pH值流动相更好。

　　通常在低pH 条件下硅醇基的活性最小，碱性化合物的峰形最好。但有时也需要或首选中性pH 方法。在许多例子中，通过使用pH 缓冲能力良好的流动相，控制其pH 值，可以提高分析物与色谱柱之间的选择性相互作用。

　　双嘧达莫是治疗心脏病的药物，它能使血管舒张，抑制凝血。图2 是用Eclipse Plus C18 柱在各种pH条件下进行双嘧达莫剂的分析，包括与pKa相差1个pH单位的流动相。尽管双嘧达莫在pH 7 和4.8 (pKa 6.4)时有两种形式的平衡，但在接近和远离pKa 的三个分离条件下，都得到了良好的峰形。

　　对药物片剂的分析可能具有挑战性，因为提取出的赋形剂、降解产物或未知成分可能对感兴趣的峰造成干扰。

　　图2 中所用的方法是梯度洗脱。用首选的低pH 流动相洗脱时，有一个未知峰（可能是降解产物）与双嘧达莫峰共流出（上图）。未知峰在中间和下面的图中用箭头标记。虽然在梯度方法中不常测定拖尾因子，在这里为了“看见”重叠峰进行了托尾因子的测定，如，低pH条件下拖尾因子较大。在pH 4.8 和7 的条件下，选择性得到了改变，两个峰得到了分离。在较高pH 条件下分离开的色谱峰有良好的拖尾因子，这也归功于出色的色谱柱和合适的梯度洗脱方法。

图3 是另一个药物，吡格列酮，分析条件与图1 中的相同。吡格列酮用于改善2 型糖尿病人的血糖控制。同样，当在通常首选的低pH 条件下分离时，有一个未知峰与分析物共洗脱，见拖尾峰。将pH 调高，改变了选择性，将吡格列酮峰与未知峰分离，结果得到了更对称的峰。吡格列酮有两个pKa：5.8 和6.4。在pH 7 条件下与pH 4.8 相比保留前移，表明该化合物在pH 6.4 条件下可能比pH 7 时的极性大。pH 4.8 的保留缘于2 个正电荷，而pH 7 时带1 个正电荷。梯度改变了离子强度可能也起到了一定作用。

　　第三种药物，利多卡因软膏，是一种皮肤局麻药。这是一种非结合型、单苯环药物，所以在254 nm 下检测信号不强（数据未显示），但在218 nm 下吸收更强，利多卡因检测灵敏度更高。图4 显示了用三种不同缓冲液分离利多卡因的色谱图。醋酸色谱图基线下移是因为醋酸在218 nm 下有一定吸收。随着梯度的改变，有机相比例增加，醋酸盐减少，UV 吸收逐渐降低。磷酸盐流动相在218 nm 几乎没有吸收，所以其基线相对平坦。如在前面的例子中所述， pH 差异强烈地影响着化合物的选择性和分离度，在整个pH 范围，甚至接近利多卡因pKa 7.9 的pH，峰形都非常好。

结论

　　Eclipse Plus C18 柱使用了增强的ZORBAX基质硅胶，这种硅胶降低了硅醇基/分析物的活性，采用了先进的键合和封端技术，进一步减少了峰拖尾。因为这种固定相的硅醇基相互作用少，有助于通过改变pH 或阴离子添加剂来改变选择性。在有机相梯度相同，pH缓冲液不同的条件下，解离的含氮药物都能从Eclipse Plus C18 柱上洗脱下来。不同的流动相pH条件改变了色谱峰的选择性，无论远离还是接近分析物pKa 值，都保持了良好的峰形。