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【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）
本人做过几年的定量PCR，有一定的经验。看到版里头有许多战友对定量有许多问题。愿意就定量PCR的问题与各位战友一起探讨。【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）
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【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-7-27 08:54 作者: 挖挖挖 来源: 分析测试百科网
最新回复
bring (2014-7-27 08:55:01)
如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右
一般有什么方法解决没有
join (2014-7-27 08:55:54)
QUOTE:
ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。
standbyme (2014-7-27 08:56:21)
zhenxin (2014-7-27 09:46:11)
挖挖挖 (2014-7-27 09:46:57)
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引物被污染。
挖挖挖 (2014-7-27 09:47:16)
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是否可以将扩增曲线贴上来看看
seagate (2014-7-27 09:47:46)
请教：
实时定量PCR，荧光定量PCR，实时荧光定量PCR，real－time PCR，这些是不是同一个概念？
总是迷惑，多谢先！
挖挖挖 (2014-7-27 09:48:13)
QUOTE:
是一个意思。remonte (2014-7-27 09:49:28)
XYZQ (2014-7-27 09:49:54)
对于定量数据分析及要求有不少疑问在论坛请教好多次（帖子地址：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7149828&sty=1&tpg=3&age=0），可惜均无人答复，不知可否请大侠帮帮忙，我现在就等搞清楚这个问题好分析数据了。谢谢先
vcve (2014-7-27 09:50:25)
eric930 (2014-7-27 09:50:49)
一直不知道
还有在融解曲线刚开始做的时候
样品会升到95度几秒钟
然后才从60度开始－－到90度
为什么要95度，而且此时的荧光值会突然大大增加？
见下图
蒲公英 (2014-7-27 09:51:17)
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是的
挖挖挖 (2014-7-27 09:51:52)
样本跑得差不多了，看试剂还多就把有些样本重跑了一次，发现两次的结果相差太大。
1。我用的看家基因作为内对照，进行相对定量（delta delta CT法），delta CT=（CT目的基因）—（CT看家基因), 通过统计比较病例组与正常组的delta CT，检测目的基因在病例组与正常组的表达差异
2。每个样本均有3个平行孔重复，即每样本的目的基因同时做3个，看家基因同时做3个，实验结果显示3个平行孔Ct值一致性很好，后来重复做的样本平行孔德一致性也好，就是两次间的差异太大，反应条件完全一样啊。
3。如果目的基因表达有变化，如降低，那么在统计时，病例组的delta CT是应该比正常组高还是低啊。
一头雾水，拜托赐教！！
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2、你是从RNA反转录开始做还是从cDNA开始做，如果从RNA开始做，可以考虑RNA是否被部分降解。如果从cDNA开始做，可能是样品被污染。
3、目的基因表达降低，那么目的基因的CT值将增大。病利组的delta CT应该比正常组的大。
zhenxin (2014-7-27 09:52:28)
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这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？
平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。
挖挖挖 (2014-7-27 09:53:02)
一直不知道
还有在融解曲线刚开始做的时候
样品会升到95度几秒钟
然后才从60度开始－－到90度
为什么要95度，而且此时的荧光值会突然大大增加？
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ROX的作用ABI宣称是用来校准加样误差的。
但是据说ROX的作用实际上是用来校准光程差的。即每个孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到CCD的时候，走过的光程是不一样的，这样在CCD上成像的亮度就不一样了。所以需要把这个差异用ROX来计算孔间差异有多大，然后差异系数去处理，实际的荧光信号。具体过程我不是非常清楚，请高手指正。
不知道你从哪里看到需要先95度？图上的位置应该也不是95度。
remonte (2014-7-27 09:54:00)
1。我将某一个标本的目的基因（3个重复孔）和看家基因（3个重复孔）一起跑，即目的基因和看家基因分管但同批跑，有说法是应该将标本的目的基因一批跑，再在另一批跑看家基因，即目的基因与看家基因分批跑，不知哪种正确
2。如果我只探讨表达的变化，而不计算病例组目的基因相对对照组的表达倍数，是否可以不用delta delta Ct 法，即不用考虑目的与看家扩增是否一致呢。直接统计两组delta Ct 差别有无统计学意义即可，可否？
挖挖挖 (2014-7-27 09:54:28)
QUOTE:
1. 应该在同一批跑比较好。这样可以消除仪器在两批之间的控制差异。当然这个必须保证目的基因与看家基因的运行程序是一样的时候。2、没有意义。因为你不知道你加入的cDNA模板是否来自相同数目的细胞的RNA所反转录来的。做了看家基因之后即可以看到实验组和对照组中这个数目的比例。
greenbee (2014-7-27 09:55:33)
平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。
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当斜率为4的时候，扩增效率是77.8%，斜率大于4的话，效率继续下降。
扩增效率的问题实际就是引物的扩增效率，可能酶活的关系没有那么重要，前提是试剂盒的质量有保证。回到扩增效率，只有在引物和模板处于最适比例时才能得到比较满意的扩增效率，因此通过调节PCR反应体系中的引物终浓度来解决，可以做一些引物梯度来比较。
JK.jon (2014-7-27 09:56:17)
2、没有意义。因为你不知道你加入的。做了看家基因之后即可以看到实验组和对照组中这个数目的比例。
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我说的delta Ct 指Ct（目的基因）-Ct（看家基因），这样不是就避免了“cDNA模板是否来自相同数目的细胞的RNA所反转录来的”这一问题吗？即delta Ct 是目的基因相对看家基因的值，然后比较病例组与对照组delta Ct的差异有无统计学意义（不用2-delta delta Ct 计算表达的相对倍数，我觉得非检验科的算出来没意义），这样不就可以说明两组表达有无变化吗？
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