分享至
NatureProtocols干细胞分离新方案
来自美国威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员在《自然-实验手册》(Nature Protocols)杂志上发表了题为“Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse”的文章，描述了一个可从同一成体小鼠的脑室下区和海马齿状回分离自我更新和多能神经干细胞(NSCs)的方案。
神经干细胞(NSCs)的特点是能够自我更新并生成中枢神经系统不同细胞类型。分离及体外分析NSCs被证实是一种破译神经发生基础细胞和分子机制，优化以干细胞为基础的神经性疾病和损伤治疗的一种重要方法。在成体哺乳动物大脑中，NSCs主要存在于两个神经发生区域：海马齿状回(SD)的颗粒下层(subgranular zone)和侧脑室的脑室下区(SVZ)。海马齿状回的颗粒下层在齿状回中生成兴奋性谷氨酸能颗粒神经元。侧脑室外侧壁的脑室下区生成嗅球抑制性GABA 能中间神经元和多巴胺能中间神经元。除生成各种不同的神经元类型，这两个区域的NSCs还可对神经营养因子和生理学或病理学情况做出不同的反应。然而对于在脑室下区和齿状回中支配NSCs不同特性和神经形成的分子机制却并不是很清楚。因此理论上在同一成体动物中确定这两个区域NSCs的固有分子特征是极其重要的。
在过去的20年里，多个研究小组开发出从成体小鼠大脑分离NSCs或祖细胞的方法。第一个成功的成体NSC培养物是从脑室下区分离的神经球，在非贴壁条件下维持。随后，一些实验室证实脑室下区NSCs也可以在贴壁单层培养物中维持。然而研究人员在作为单层细胞维持的小鼠NSCs中看到了自发性的分化。因此，尽管神经球和贴壁培养系统都有pros和cons，提供三维环境的神经球更有利于NSCs维持。因此神经球培养物仍然是分离和维持成体NSCs 最普遍和最可靠的方法。值得注意的是，在当前方案被设计出来之前，分离成体脑室下区NSCs需要至少2个，通常是4-6只成体小鼠。
在这篇文章中，作者们提出了一个可从同一成体小鼠的脑室下区和海马齿状回分离自我更新和多能NSCs的新方案。这一方法涉及对来自成体小鼠大脑的脑室下区和海马齿状回进行显微切割，从特异区域分离出NSCs，及体外培养NSCs。整个步骤只需2-3小时。这一突破之处在于整个方案只需要一只成体小鼠，且可从同一成体小鼠可靠地分离出来自海马齿状回的颗粒下层和侧脑室外侧壁的脑室下区的NSCs。其尤其适用于可获得小鼠数量受限的研究，例如包含多个遗传修饰的小鼠。
实验方案的主要步骤：
1.选择小鼠大脑，切成400μm组织(需5-10分钟)
2.解剖脑室下区和海马区(20-30分钟)
3.分离为单细胞(1-2小时)
4.NSCs的培养和维持(随实验需要调整时间)
5.在初始增殖培养基(IPM)中初期培养细胞7-14天，隔一天替换一次IPM
6.在IPM中传代齿状回细胞并在这一培养基中维持7-10(第一代)或是在N2培养基中传代脑室下区细胞，并在这一培养基中维持5-7天(第一代)
7.在N2培养基传代齿状回细胞，并在这一培养基中维持5-7天(第2代)
8.用N2培养基在10cm培养皿中维持分离的脑室下区和海马区NSCs。每隔2-3天传代一次。
