人胚胎干细胞分化成神经前体细胞和多巴胺能神经元
实验概要
人胚胎干细胞分化成神经前体细胞和多巴胺能神经元
主要试剂
DPBS、DMEM/F12、1.5
U/mLDispase、鼠黏连蛋白（Laminin，20
μg/mL）、1U/MlAccutase酶、人胚胎干细胞拟胚体形成培养基、神经诱导培养基（NIM）、人神经分化培养液（NDM）、FGF8（50ng/mL）、SHH（100ng/mL）、Vc、cAMP、TGFβ3、BDNF、GDNF
主要设备
一次性5mL或10mL移液管、6孔板、T25培养瓶、T75培养瓶、15 mL或50 mL离心管、0.22μm一次性滤膜
实验步骤
（1）收集hES细胞，悬浮培养形成拟胚体（Embryoid body, EBs）
①实验开始前10min，在37℃水浴中孵育DMEM/F12、1.5 U/mL的Dispase和EB培养基。
② 吸去6孔板中各孔hES细胞的培养基。
③用DMEM/F12洗细胞一次。
④吸去DMEM/F12后，在6孔板的每个孔中加入1mL的1.5 U/mL的Dispase。
⑤ 在培养箱中孵育5～15min，定时在相差显微镜下观察细胞形态变化。当显微镜下观察到hES细胞的边缘开始卷曲时，从6孔板中吸掉Dispase并加入DMEM/F12轻柔吹打细胞。
⑥ 用一次性的5mL或10mL移液管收集hES细胞克隆。用移液管管头将皿底的hES细胞从底面上划下来，并上下反复轻柔吸打将克隆打碎成直径200µm左右的细胞块。
⑦ 室温800r/min离心2min，吸弃上清，用EB培养基重悬干细胞克隆，并将细胞悬液转移至T25或T75培养瓶中。
⑧ 悬浮培养12～18h后更换新鲜培养基，去除死亡的细胞，如果有必要的话可以更换培养瓶去除残留的已贴壁的饲养层细胞。
（2）神经上皮细胞的分化
① 分化4日后，倾斜放置培养瓶，将拟胚体聚集于培养瓶一角后，吸去所有EB培养基，用NIM重悬，继续培养。
② 两日后半量换液。
③ 次日，将拟胚体悬液转移至离心管，静置10～15min使集落沉淀于管底，去除培养基。
④ 用含20 μg/mLLaminin的NIM培养液重悬细胞，将1个T75瓶中的hES集落接种于2个6孔板中。
⑤ 第二日吸出含Laminin的NIM培养液，6孔板的每个孔加入2mL新鲜的NIM。
⑥ 每隔一日更换一次新鲜的NIM培养液。每日观察，在贴壁2～3日后克隆中的细胞将形成花环样结构，这一时期我们称之为原始神经上皮。
⑦ 在NIM进一步培养4～5日，花环的紧密程度将增加，并且每个克隆可包含多重神经管样的花环内腔，这个时期可称之为神经上皮。
（3）神经上皮的富集与扩增
在分化第14～16日形成神经管样花环结构后，吸出每孔旧的培养基并加入1mL的新鲜NIM培养基。
用1mL移液管温和吹下神经上皮结构，收集于离心管中。
用5mL或10mL的移液管上下来回吸打几次，将神经上皮结构吹成小块。
室温700r/min离心2min，吸弃上清。
⑤ 用NIM培养液重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至T25培养瓶中。
⑥ 次日观察，可发现花环结构重新卷曲成球形悬浮生长。
⑦ 每隔一日用含1% B27的NIM培养液给悬浮成球生长的神经前体细胞半量换液。
（4）由神经前体细胞分化形成神经元
①神经上皮集落可以悬浮培养数周至几个月。
②将圆形盖玻片放于24孔板中，在使用前用0.1mg/mL的多聚鸟氨酸孵育过夜，此后再加含20μg/mL laminin的NDM，37℃放置3h以上。
③在37℃水浴中温浴Accutase酶、DMEM/F12和NDM培养基。
④收集神经上皮细胞集落于15mL离心管中，让集落自然沉淀于管底。吸去培养基。
⑤加入500µL的Accutase酶37℃孵育2～3 min。加入等量的NIM培养基稀释酶的消化作用，室温1000r/min离心3min。
⑥吸弃上清，并用DMEM/F12洗涤一次。
⑦ 向管中加入1mL的NDM培养基并用200μL移液器的枪头在管底来回吸打将细胞打碎成小的群落或单个细胞。
⑧ 将细胞接种于事先经过多聚鸟氨酸和Lamin处理的盖玻片和培养皿中。6孔板中的每个孔可以接种50～60个集落，一个盖玻片可以接种8～10个集落。
⑨在细胞接种后2～3h观察细胞是否贴于培养皿底部，如果已经贴壁，则在6孔板的每个孔中加入2mLNDM，在24孔板的每个孔中加入0.5mLNDM。
⑩ 用相同的培养基每隔两日给细胞换液一次，2-3日后可以观察到神经元的神经突触。
（5）人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能神经元
由hES细胞分化为原始的神经上皮细胞的方法如前所述，但是需要注意的是在此分化过程中，在分化至第8～10日时，在NIM培养基中加入FGF8b（50ng/mL）和SHH（100ng/mL）。
② 持续培养细胞7日，每隔一日用相同的加入FGF8b和SHH的培养基换液，直到形成神经管状花环样结构。
当分化至富集和扩增神经上皮细胞阶段时，在NIM培养基中加入FGF8b（50ng/mL），SHH（100ng/mL），B27（1×)和Vc（200µM），并每隔一日换液一次。
④ 悬浮培养7日后，神经前体细胞集落用accutase消化成小团块，接种于表面预先铺有PDL和laminin的培养皿中。
⑤ 细胞贴壁后，每隔一日用含有FGF8b，SHH，Vc，cAMP，TGFβ3，BDNF，GDNF的NDM培养基换液，持续三周。
⑥ 在分化44日后，撤去含FGF8b，SHH的培养基，并用含有Vc，cAMP，TGFβ3，BDNF和GDNF的NDM培养基继续维持细胞。
⑦ 在分化35日之后，可以用免疫荧光染色的方法对分化的多巴胺能神经元进行鉴定，如进行多巴胺能神经元特异性标记物TH的染色。
