AB SCIEX液质联用系统在瘦肉精类物质分析中的应用

2011-5-20 18:08 来源: 分析测试百科
收藏到BLOG

  2011年5月18日,AB SCIEX公司与分析测试百科网联合举办了“AB SCIEX液质联用系统在瘦肉精类物质分析中的应用”网路视频讲座。本次讲座是由AB SCIEX公司朱林老师和广州市农业标准与监测中心朱铭立老师为大家作报告,主要介绍了食源性瘦肉精类物质残留的背景及现状,瘦肉精类物质分析的前处理方法讨论,AB SCIEX质谱仪特点及优势,AB SCIEX液质联用分析瘦肉精类物质的应用实例等四部分内容。

  食源性瘦肉精类物质残留的背景及现状

  首先,AB SCIEX公司朱林老师向大家介绍了食源性瘦肉精类物质残留的背景及现状。瘦肉精是一类动物用药的统称。任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”,一般指β-兴奋剂类,如克伦特罗、莱克多巴胺等。该类化合物热稳定性差、极性强,适合于进行LC/MS/MS分析。盐酸克伦特罗在肌肉特别是在内脏中会有高浓度的残留,对人与动物的肝、肾及神经系统产生危害。欧盟最早颁布法规93/257/EWG(revision 98/536/EG)禁止其作为饲料添加剂使用,美国和加拿大也禁用,我国农业部亦发文作出同样规定,禁止使用包括莱克多巴胺在内的任何“瘦肉精”类物质。

  莱克多巴胺,加拿大和WHO的猪肉标准40ppb,联合国粮农组织则是10ppb;日本和新西兰规定本国生产不允许使用,但进口猪肉则允许有小于10ppb的残留。FDA和WHO规定了盐酸克伦特罗在动物体内的最高残留为:肉0.2µg/kg、肝0.6µg/kg、肾0.6µg/kg、脂肪0.2µg/kg、奶0.05µg/kg;日本的规定是0.05µg/kg(ppb);中华人民共和国农业部第193号公告中将盐酸克伦特罗列为违禁药品,规定在动物体内的残留标准为:马、牛肌肉0.1µg/kg,肝、肾0.5µg/kg,牛奶0.05µg/kg。

  瘦肉精类物质分析的前处理方法讨论

  随后,朱铭立老师为大家详细介绍了瘦肉精类物质分析的前处理方法讨论。动物源性食品、动物尿样、饲料中瘦肉精类物质分析,首先要进行酶解、提取和净化等处理。动物组织的前处理:取2g捣碎样品,加入8mL乙酸钠缓冲液(pH=5.2),再加入50µLβ盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶溶液,涡旋混合,37℃下避光水浴震荡12h。然后加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL,混匀,用高氯酸调pH至1±0.3,离心取上清液,用氢氧化钠调pH至11,加入10mL乙酸乙酯-异丙醇混合液和10mL饱和氯化钠溶液,震荡10min离心,收集有机相,40℃下水浴氮吹,5mL乙酸钠缓冲液(pH=5.2)溶解,待净化。尿样的前处理:取5mL尿样,加入0.5mL2mol/L的乙酸铵缓冲液(pH=5.2),再加入40µLβ盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶溶液,涡旋混合,37℃下避光水浴震荡16h。取上清液10mL于50mL离心管,用氢氧化钠调pH至9.8±0.2,加入10mL乙酸乙酯-异丙醇混合液,再加入1.5~2.0g氯化钠,震荡10min离心,收集有机相,重复提取一次,合并有机相,50℃下旋转蒸干,5mL2mol/L的乙酸铵缓冲液(pH=5.2)溶解,待净化。饲料样品前处理:取饲料样品10g,加盐酸甲醇溶液19mL,1mL饱和醋酸铅(沉淀蛋白)。超声震荡萃取30min,离心10min,取上清液待净化。

  盐酸克伦特罗为弱碱性药物,在碱性条件下(pH-pKa>2)时,盐酸克伦特罗以分子形式存在。提取的第一步中采用高氯酸溶液酸化化基质,盐酸克伦特罗以离子形式存在,易溶于水中,将其提取出来;在第二个步骤中,通过加入NaOH溶液碱化化基质,这时候盐酸克伦特罗以分子形式存在,易溶于乙酸乙酯-异丙醇混合液,从而被萃取到有机相中。

  取待净化液过MCX柱(3mL甲醇、3mL水活化,待净化液过柱,再依次用3mL水,3mL2%甲醇-水溶液,3mL甲醇淋洗,5mL5%氨水甲醇溶液洗脱),洗脱液在40℃水浴中用氮气吹,浓缩至1mL,再用0.45µm滤膜过滤,即获得样品溶液。上样和淋洗,保留的溶剂体系要求pKa-pH>2,不含有高选择性的反离子和低离子强度;洗脱,保留时的溶剂体系要求pH-pKa>2,含有高选择性的反离子和高离子强度。

  AB SCIEX质谱仪特点及优势

  接下来,朱林老师又介绍了AB SCIEX质谱仪卓越的性能特点及技术优势。AB SCIEX质谱仪的特点是:强大的离子源,高灵敏度,抗污染能力强;高抗污染能力的接口,优异的重现性;LINAC离子碰撞室,高通量、多目标、超快速同时检测;优异的稳定性和耐用性;独有QTRAP技术,真正同时在线定量定性分析。总得来说,AB SCIEX串联质谱不仅独有QTRAP技术,性能优异,仪器稳定可靠,而且易用、易维护。

久经考验的专利气帘接口技术

  Turbo VTM大气压离子源有两路加热雾化器,使离子化更为充分,负压使离子化气流更符合空气动力学。久经考验的专利气帘接口无毛细管或复杂装置,不会堵塞;无需加热,不会引起化合物热分解;专利气帘设计,抗污染能力强,灵敏度高;利于去离子族化,离子流稳定,重复性好。专利LINACTM高压碰撞室能够分析更低含量杂质,而且分析结果更加可靠。QTRAP同时具备串联四极杆和线性离子肼结构,可在线实时切换,轻松实现在线定量定性分析。

  相关产品:4000 Qtrap四极杆-线性阱复合型质谱仪

  AB SCIEX液质联用分析瘦肉精类物质的应用实例

  在AB SCIEX液质联用分析瘦肉精类物质的常见应用实例方面,朱铭立老师先为大家列举了克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、班布特罗、妥布特罗、马贲特洛、赛布特罗、溴布特罗、福莫特罗、喷布特罗、氯丙那林片和特布他林等14种瘦肉精类物质的分析实例,展出了标准品溶液1ppb离子色谱图,猪肉加标溶液离子色谱图,某饲料样品离子色谱图(检出莱克多巴胺),洗猪槽水实际样品色谱图(检出莱克多巴胺),猪尿样品稀释5倍直接进样实际样品色谱图等。

AB SCIEX QTRAP® 4000系统

  接着,朱林老师给大家举了一个用AB SCIEX QTRAP®4000系统分析克伦特罗的例子。0.05ppb Clenbuterol标准品连续进样6次重现性CV值为1.4%,实际样品Clenbuterol连续进样6次重现性CV值小于4%。

  最后,朱林老师讲述了一件出口肉类产品瘦肉精超标争议事件。对某省一批出口肉类中兽药克伦特罗的检测,结果符合进口国限量标准。货物抵达进口国后,经该国检测机构测试发现克伦特罗超标,导致货物被扣,并面临巨大的经济损失。经教授采用QTRAP技术检测发现,实际为克伦特罗MRM假阳性判断。几乎所有样品的克伦特罗真实含量均低于限量的要求,部分样品甚至根本未检出。

 

Q&A

  网友:瘦肉精类物质分析的时候,回收率总是很低,是什么原因?如何改善?

  朱铭立老师:瘦肉精这类物质分析时回收率很低的话,应从几方面去改善:一是通过倒推方法,判断回收率低是在哪一过程中产生的,若是洗脱出了问题,要看一下洗脱溶剂的极性与量够不够;二是在实验中要严格控制控制pH值和柱子的流速。

  网友:分析猪尿样品时,不净化稀释直接进样,是否会对仪器造成污染?定量结果是否准确?

  朱林老师:朱铭立老师将猪尿稀释成5倍的样品,然后直接上机,根据谱图可以看到,对分析器没有什么干扰。再一次证明了我们的仪器有非常好的抗污染能力,当然它只是一个快速筛查,能够确定有还是没有。要做进一步分析的话,可以先做样品前处理,然后定量。

  网友:目前瘦肉精的检测,只能用LC-MS吗?

  朱铭立老师:对于瘦肉精的检测,不是只能用LC-MS方法。现在有很多种方法用于检测瘦肉精,如酶联免疫法、液相色谱法、气质联用仪法。但是,酶联免疫法常会出现假阳性或假阴性的现象,使结果出现一定的不确定性;液相色谱法灵敏度不够,检测比较单一的微量兴奋剂,而现在兴奋剂种类越来越多,无法用液相色谱去准确定量,甚至检测不到;GC-MS样品前处理比LC-MS要求更复杂,而且兴奋剂极性大、热稳定性差,不适合直接用GC-MS检测,故需要对样品进行衍生化,衍生效率的高低决定了检测的好坏,而且它需要较长的时间,影响了实验的效率,GC-MS的灵敏度也远低于LC-MS,所以用LC-MS检测兴奋剂将是一种趋势。

  网友:前处理过程中为什么要使用酶?

  朱铭立老师:因为β兴奋剂大多有苯乙胺醇和叔丁基或异丙基连接而成的,根据苯环上取代基的不同,一般可分为苯胺基、苯酚或淀粉三种类型,对于苯酚、淀粉苯环上那个羟基是结合的位点,β兴奋剂在体内代谢完,会跟羟基结合,形成一个葡萄糖醛干的代谢物,这就需要酶解游离出来,才能进行检测。对于猪尿样品,除了苯酚类的β兴奋剂之外,其它经过体内代谢完之后,一般在猪尿里是以原形态形式存在的,所以有些标准对猪尿的检测就没有酶解这一步。但是,对检测苯酚类的β兴奋剂时需要酶解的。

  网友:有些厂家的仪器在进行体内样品分析时,可以将进样前几分钟的样品弃去来减少污染,AB SCIEX 的仪器是如何解决这个问题的?

  朱林老师:我们仪器上有一个切换阀,可以设置一个切换时间,比如说设置前几分钟,样品不进仪器,而是排到废液里,然后再过几分种样品进入仪器,从而起到保护仪器的作用。

  网友:何种情况适合使用MRM3定量这种方式?有什么优点?

  朱林老师:这是QTRAP独有的特点,通常情况下做实验是用二级质谱来做定量分析MRM,有时候背景很高或干扰峰存在去不掉,优化色谱条件需要时间,更换离子对影响灵敏度,改变母离子的选择性或改变分辨率等都不奏效的时候,使用MRM3技术可以轻松把这个背景去掉。

  网友:请问QTRAP就是API 4000吗?

  朱林老师:不是。有一款型号是API 4000,还有一款是API 4000 QTRAP,这两款是完全不同的仪器,具有不同的功能,但四极杆对于这两款仪器具有完全的功能。

  网友:Q0~Q2都是传输的作用,只有Q3才是真正的质量分析器吗?

  朱林老师:Q0是预四极杆,起到传输作用,Q1是选择母离子用的,Q2又是一个传输,传输一些子离子碎片,Q3又是一个分析器。对于这个串联质谱,Q1和Q3是两个分析器,Q0和Q2都只起到传输作用。

  网友:QTRAP是怎样实现离子肼功能的,它是靠四级杆两端的端盖电压吗?

  朱林老师:不是。这是在四极杆的基础上有全新的硬件和软件设计,在Q3后端加了一个金属的装置,它跟普通的四极杆上的电压是不一样的,依靠四极杆电压是不能来实现这个功能的。

  下载网络视频讲座:AB SCIEX液质联用系统在瘦肉精类物质分析中的应用