第二十九期质谱沙龙活动报道
Triple TOF 5600 在生物标志物发现中的应用
郭立海博士作了题为《Triple TOF 5600 在生物标志物发现中的应用》的报告，主要介绍了蛋白质组发展趋势及其对质谱技术的要求，Triple TOF 5600分析蛋白质的三种应用，Triple TOF 5600独特的设计支持了同时定性定量等内容。
AB SCIEX公司 郭立海 博士
蛋白质组发展趋势及其对质谱技术的要求
郭博士首先描述了蛋白质组概念，并和基因组作了简单比较。接着郭博士对发现、靶向蛋白质组和定性、定量蛋白质组的概念进行了形象地解释并从中阐述了蛋白质组的发展趋势。
发现蛋白质组（Discovery Proteomics）类似于撒网捕鱼策略，优点是快速、大规模、高通量，能得到大量数据和信息；缺点是数据太多，数据后期处理比较麻烦，大量的数据中有意义的数据少，不一定能得到直接感兴趣的数据。这是传统蛋白质组学。靶向蛋白质组（Targeted Proteomics）的靶向性和目的性都很强，类似于采用特异性强的诱饵，有目的性的同时在多个区域大规模放置钓竿，钓得研究者真正感兴趣的、最有研究潜力的鱼，撇开其它的干扰，从而加速针对性强的研究。这是最近两年才兴起的新的蛋白质组学方向。
定性蛋白质组（Qualitative Proteomics）就是解析蛋白质的一级结构信息，包括这个蛋白质的氨基酸序列是什么，发生了怎样的结构变化或翻译后修饰等，比如蛋白质表达谱、修饰谱等。定性蛋白质组是蛋白质组研究的基础，起步的蛋白质组主要是鉴定生物样品里都含有什么蛋白质，现在依然很重要，因为生物体里还有大量的蛋白质并未被鉴定，大量的修饰信息还未被覆盖。定量蛋白质组（Quantitative Proteomics），靶除了知道是什么蛋白或发生了怎样的修饰外，还要给出量的信息，这是后蛋白质组时代的要求。因为蛋白质组是动态的，研究在某种特定条件下蛋白质量的变化才有可能揭示真正的生物学问题，况且生物标志物本身就是靠定量来发现的，这是现在蛋白质组研究的重中之重。尤其是近几年来各种同位素标记方法（iTRAQ试剂）和串联四极杆特定的定量方法-MRM应用在蛋白质研究中，更是推动了定量蛋白质组的蓬勃发展。
定性、定量蛋白质组研究对质谱技术提出了很高的要求，定性方面要求质谱仪器灵敏度高、速度快、准确度和分辨率高；定量方面首先要求定性，同时要定量动态范围宽、 定量准确度高、稳定性和选择性好。AB SCIEX公司推出的Triple TOF 5600可以实现漂亮的定性，同时兼做定量。高分辨率、高质量准确度、高灵敏度、高采集度和高定量线性动态范围，在MS和MS/MS，在定性和定量，总是同时达到。
Triple TOF 5600分析蛋白质的三种应用
接下来，郭博士重点讲述了Triple TOF 5600 在蛋白质组分析方面三种应用模式（技术路线）。
IDA定性
IDA是纯定性的，目的是鉴定更多的蛋白质。IDA工作模式是先进行色谱分离，然后进行质谱扫描，一级扫描结束后要快速进行二级扫描，这样才能鉴定出更多的蛋白质。同时，一级扫描和二级扫描全部是高分辨的，能把更多的峰区别开来，从而鉴别蛋白质的数量也就增多。接着，郭博士举了酵母细胞裂解物实验以及大肠杆菌和植物蛋白等检测的例子，均证实Triple TOF 5600表现出很好的效果。
定性定量，label free
定性定量兼做实际上是做蛋白质组的时候做非标记定量。比如说两组蛋白——一组是疾病样，一组是正常的，然后进样比较鉴定蛋白质，根据峰面积看哪些蛋白质发生了变化。它的工作模式也是先进行色谱分离，然后进行一级扫描，一级峰面积是用来定量的，可以计算肽的相对量是多少。一级扫描速度要慢，从而得到更多的数据点，同时分辨率也会更好一点。因为是高分辨率，所以提取峰的窗口可以缩到很小，达到消除干扰，提高特异性的目的。随后有很多的二级扫描，速度比较快，这主要是来定性的。接着，郭博士举了人体蛋白酶酸化肽的例子。
高分辨MSMS定量（MRMHR）
高分辨MSMS定量与MRM有所不同，它在方法中要指定母离子，消除背景干扰，定量更准确，而没有指定碎片离子。打入几十或几百个母离子去扫描，就能得到所有母离子碎片，相当于不做一级扫描，直接进行母离子碎片二级扫描。由于扫描速度快，能够对所有母离子碎片进行全扫描，而不是特异扫描，然后从中截取三个较好的响应值叠加到一起，消除定量差异性。高分辨对定量的好处是能够进一步缩小截取的窗口，消除干扰，提高选择性。接着，郭博士举了一个血浆样品中蛋白质分析的例子。
Triple TOF 5600独特的设计支持了同时定性定量
Triple TOF 5600是第一台集高准确质量数、高分辨、高扫描速率和高定量灵敏度为一体的系统，一次进样就可完成复杂样品中低含量化合物的定性确认和定量分析，能非常方便地从定性工作流程（如定性确认、筛查）转化为定量分析。那么，Triple TOF 5600到底有哪些独特的设计，同时实现了定性定量？
AB SCIEX Triple TOF™ 5600
AB SCIEX Triple TOF™ 5600系统特点为：
- 高灵敏度，在全扫描和二级质谱扫描方式，灵敏度达到业界高端QQQ质谱的MRM水平；
- SmartSpeed™ 100Hz采集速率，每秒可完成100次MS/MS 或MS扫描；
- 高分辨率，在任意扫描速度下质谱分辨率都可达到40000；在低质量端m/z 100左右，也可达到30,000以上的分辨率；
- EasyMass™ 准确度，质量准确度小于1ppm(RMS)；
- 线性动态范围，可达5个数量级；
- 系统非常可靠，用外标法，质量误差长期可以保持在~1ppm。
与仪器配合使用的还有用于快速简便地处理/显示大量质谱数据的峰观测(PeakView™)软件，用于简化小分子和大分子定量流程的多组分定量(MultiQuant™)软件，用于简化蛋白质组学研究的蛋白导航(ProteinPilot™)软件等。AB SCIEX Triple TOF™ 5600系统在高级飞行管、光学聚焦技术、真空系统等硬件方面也有重大改进。TripleTOF 5600系统为生命科学家在复杂样品的全面分析、快速筛选和高分辨定量等方面提供了强大的、新的工作流程，这些性能是在其它类型的质谱中不可能获得的。
本网收录：TripleTOF™ 5600质谱系统
血浆样品的快速处理方法
天津博纳艾杰尔科技有限公司韩勇技术工程师作了题为《血浆样品的快速处理方法》的报告，主要介绍了天津博纳艾杰尔科技最新的三款产品——蛋白沉淀板、SLE和MAS及其应用和各方法比较。
天津博纳艾杰尔科技有限公司 韩勇 技术工程师
蛋白沉淀板
传统的蛋白沉淀法的缺点：繁杂的加样、涡旋、离心、转移等操作，可能造成药物损失；不是一种高通量的方法；不适用于自动化的仪器。Cleanert蛋白沉淀产品有两种产品形式。在方法开发时可以使用柱形管式，在处理实际样品时可以使用96孔板形式。疏水性筛板具有阻挡以水为主要成分血浆的下渗，阻挡变性蛋白，乙腈、甲醇等有机试剂易于通过等性质。蛋白沉淀板的优点是：获得更洁净的样品，操作简便快速、减少样品损失，是一种高通量的样品处理方法，与自动化萃取仪器兼容，传统蛋白沉淀方法的简单移植。
SLE
液液萃取法的缺点：繁杂的加样、涡旋、离心、转移等操作，可能造成药物损失；产生乳化现象；不是一种高通量的方法；不适用于自动化的仪器。SLE采用特殊工艺处理的硅藻土为填料，此填料具有较大的比表面积和较低的表面活性，能够提供一个理想的液液分配的支撑表面。SLE 的操作方法：血浆样品上样，样品在硅藻土表面形成一层薄薄的液膜；静置5分钟；加入适量的洗脱溶剂洗脱，重力洗脱，洗脱溶剂包裹在样品层外部，两液膜间进行微观的液液萃取。SLE的优点是简便快速、是一种高通量的样品处理方法，避免液液萃取容易产生的乳化现象，与自动化萃取仪器兼容，液液萃取方法的移植。
MAS
固相萃取法的缺点：方法建立较为复杂，为了获得良好的回收率和净化效果，常常需要调节上样的pH值以及淋洗液和洗脱液的强度；操作仍较为复杂、耗时；对极性较强的药物效果不好。MAS（Multi-function Impurity Adsorption SPE），即“多重机制杂质吸附萃取净化法”，该方法主要利用多官能化的复合吸附材料，以离子交换、反相、氢键等机理去除生物样品中的主要内源性干扰物质，同时将目标药物留在样品溶液中，从而达到净化的目的。疏水性的筛板可以阻挡以水为主的血浆和变形的蛋白，而乙腈等有机试剂易于通过，填料吸附杂质而不吸附药物。MAS的操作方法：乙腈活化，负压或正压抽干；血浆样品上样；快速加入乙腈洗脱，同步完成蛋白沉淀与药物提取；加正压或负压，收集洗脱液，进行后处理或直接检测。MAS的优点是：操作简便、快速、是一种高通量的前处理方法，较好的除磷脂效果，极好的平行性，适用于强极性药物，与自动化萃取仪器兼容。
最后，韩工介绍了血浆中氢氯噻嗪蛋白沉淀方法的建立，血浆中托特罗定SLE方法的建立，血浆中托特罗定MAS方法的建立；血浆中普萘洛尔MAS方法与蛋白沉淀法的比较，血浆中地塞米松蛋白沉淀法、SLE法和MAS法检测结果比较等。
