一种新的基因编辑方法---基于PfAgo的人工限制酶
在一项新的研究中，美国伊利诺伊大学香槟分校化学与生物分子工程系教授Huimin Zhao和研究生Behnam Enghiad开创性地开发出一种新的基因工程方法用于基础生物学研究、应用生物学研究和医学应用。他们的研究有潜力通过改善DNA切割的精确度和忠诚度为基因组研究打开新的大门。相关研究结果于2017年2月6日在线发表在ACS Synthetic Biology期刊上，论文标题为“Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes”。
Zhao说，“利用我们的技术，我们能够构建出高度活性的人工限制酶（artificial restriction enzymes, AREs），这些AREs几乎对任何一种序列产生特异性，而且能够产生确定的长度可变的粘性末端。这是生物技术领域的一个罕见的例子，在这个领域里，人们能够以一种理性的方式轻松地和准确地设计一种想要的生物学功能或试剂。”
限制酶是基因组研究的一种重要的工具：通过在特定的位点切割DNA，它们产生切口，供外来DNA插入，从而实现基因编辑的目的。这个过程不仅是通过自然发生的限制酶实现的，而且其他的AREs近几年来日益吸引人们的关注。用于“剪切-粘贴”基因编辑的细菌免疫系统CRISPR-Cas9和修饰的限制酶TALEN是这类技术的两个流行的例子。
尽管在基因工程中有用处，但是没有AREs会产生确定的“粘性末端”。粘性末端指的是DNA梯形结构在限制酶的作用下会产生不平齐的切口，留下几个突出的核苷酸，它们之间正好互补配对。当插入新的DNA时，粘性末端会提高插入成功率。Enghiad解释道，“如果你能够利用相同的限制酶切割两种不同的DNA样品，那么产生的粘性末端是互补的。它们彼此之间发生杂交。如果你使用一种连接酶，那么你能够将它们连接在一起。”
然而，限制酶本身有一种重大的缺点：促使它们进行切割的识别序列是非常短的---通常仅为四到八个碱基对。鉴于这些酶会在这种识别序列出现的任何地方进行切割，因此科学家依赖于发现切割位点在有机体的基因组或质粒中仅出现一次的限制酶。当手边的DNA长几千个碱基对时，这经常是一个难题。
这个问题可部分上通过发现的限制酶的绝对数量加以解决：已描述了3600多种限制酶，但仅有250多种限制酶是市场上可买到的。Enghiad说，“在我们的冰箱里，为了我们的其他研究，我们很可能有100多种不同的限制酶。每当我们想要组装东西时，我们仔细查看它们，但是发现独特的限制位点的几率是非常低的。”
“我们的新技术将所有的这些限制酶统一到由一种蛋白和两种向导DNA组成的单个系统中。你不仅能够替换它们，而且你如今也能够靶向其他的限制酶不能够靶向的限制位点。”
Enghiad和Zhao开发的这种技术是通过使用一种从强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）提取出的Argonaute蛋白（PfAgo）构建AREs。当PfAgo发现它的切割位点时，在一种向导DNA的引领下，它能够识别更长的序列，从而增加它的切割特异性，消除了限制酶带来的很多障碍。再者，PfAgo甚至能够比限制酶产生更长的粘性末端，相比于其他的AREs，这是一种重大的益处。
Enghiad解释道，“当我们开始研究时，我受到一篇针对一种相关蛋白TtAgo的论文的启发。它能够使用一种向导DNA切割DNA，但仅在高达70℃下才会进行切割。DNA链在75℃以上开始分离，这能够允许一种蛋白产生粘性末端。我推断，如果一种蛋白在更高的温度下有活性的话，那么这种蛋白能够作为一种人工限制酶发挥作用。”
“因此，我开始寻找这样的人工限制酶，结果我发现了PfAgo。”
除了替换用于基因工程的限制酶，Enghiad和Zhao认为他们的技术将在生物学研究中具有广泛的应用。通过产生任意长的粘性末端，PfAgo能够更加容易地组装大分子DNA，并且能够克隆大分子DNA。
这种技术的应用是非常广泛的。它的应用范围从发现新的小分子药物到设计微生物细胞工厂用于合成燃料和化学物，再到对遗传病和病原体进行分子诊断。这些都是Zhao和Enghiad当前正在研究的领域。
Zhao说，“由于它的史无前例的简单性和可编程性（单个DNA，加上用于靶向的向导DNA）以及可获得性，我们期待在所有的基于限制酶或核酸酶的生物技术应用和基础生物学研究中，基于PfAgo的AREs将变成一种强大的必不可少的工具。它在分子生物学中的作用就好比是CRISPR技术在细胞生物学中的作用。”
