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质粒DNA的限制性内切酶（restriction endonuclease, RE）酶切及..

2020.9.08

实验原理：
限制性内切酶（restriction endonuclease, RE）能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。限制性内切酶可分为三类：I、Ⅱ和III类。I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的切割。I类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。I和III类酶在分子克隆中都不常用。
Ⅱ类酶由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4~6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5′-CCC↓GGG-3′）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5′…G↓AATTC…3′
3′…CTTAA↑G…5′
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，限制性片段长度多态性 (RFLP) 技术更是建立在它的基础上。
质粒DNA酶切片段的回收：DNA片断的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术，例如可收集特定酶切片断用于克隆或制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。
本实验采用的是Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒。该试剂盒从普通琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA的原理是：在凝胶融化液（Buffer DE-A）中凝胶块被迅速融化并释放出DNA。加入高盐DNA结合液（Buffer DE-B）后DNA片断被选择性吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到silica膜上的DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学实验。
实验材料：
[1].实验8获得的GAPDH-T载体重组质粒DNA
[2].10×TBE缓冲溶液
[3].6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4℃
[4].10mg/ml溴化乙锭
[5].Sal I：MBI Fermentas Life Sciences
[6].Kpn I：MBI Fermentas Life Sciences
[7].琼脂糖(Agarose)
[8].琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒
[9].质粒DNA电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪，微波炉，琼脂糖凝胶成像系统。
[1].实验步骤： NA酶切反应体系(30μl)组成为：

[2].简单离心混匀。酶切反应在37℃保温1~16h。
[3].将全部酶切液都加于1%琼脂糖凝胶上，80V电泳适当时间。
[4].电泳后在紫外灯下，用酒精火焰灭菌的刀片将含目的条带的凝胶切下，并将含DNA条带的凝胶块切碎，装入灭菌的1.5ml eppendorf管中，称重并记录凝胶重量。
[5].按“凝胶重量（mg）：Buffer DE-A (μl) = 1：3”的比例，向凝胶块中加入Buffer DE-A。
[6].75℃水浴保温，期间每2~3min颠倒混合一次，至凝胶彻底溶化。Buffer DE-A为凝胶融化剂，也含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解。
[7].加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。Buffer DE-B为结合液，可促使大于70bp的DNA片段选择性的结合到DNA制备膜上。
[8].将溶液转移到DNA制备管（置于2ml离心管）中，12000g离心1min，弃滤液；如果一次加不完，可分两次离心。
[9].将DNA制备管置回离心管，加500μl Buffer W1，12000g离心30s，弃滤液。
[10].将DNA制备管置回离心管，加700μl Buffer W2（第一次使用前向Buffer W2 concentrate中加入瓶上指定体积的无水乙醇），12000g离心30s，弃滤液。
[11].将DNA制备管置回离心管，加700μl Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液（去盐）。
[12].将DNA制备管置回离心管，12000g离心1min（除去残余酒精）。
[13].将DNA制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25~30μl Eluent （2.5mM Tris-HCl, pH8.5）或灭菌去离子水，室温静置1min；12000g离心1min，收集DNA。
[14].纯化的PCR产物用琼脂糖电泳法检测，用紫外分光广度计测定浓度。
注意事项：
[1].酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
[2].酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1h完全降解1μg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不像λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
[3].市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
[4].观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光切割DNA。
[5].EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
[6].当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30min后再观察。
示例图片：