Ion Torrent新一代测序仪介绍
引言
整个或部分基因组测序的研究问题已解决，研究者的研究重点向着遗传密码如何编码调控细胞功能方向转移。同样，在分子水平了解人类健康状况，基因序列数据则显得更加重要。大多数的测序都是针对部分基因序列或是一段目标区域，提供必需的数据来解释给定假说。利用PCR技术很容易从基因组中扩增得到一个离散的基因序列，当用该技术对靶序列进行测序的时候，通常被叫做扩增子测序。
根据假设，扩增子测序通常用于多个样品中几个到几百个基因区域的研究。了解人类健康是医疗诊断的目的，扩增子测序技术在医疗诊断方面显得非常重要。传统的桑格测序法无法在大规模的多种样品测序中满足实验的要求。下一代测序技术在过去五年的发展中显著提高了测序通量，然而，在小规模的基因组测序中，NGS的测序仪器比较笨重，测序速度慢，成本也高。
Ion Torrent测序仪是唯一适用于扩增子测序技术的仪器，因其革新性，简单、快速、可扩展并且经济实惠。本文介绍了如何使用Ion Torrent进行扩增子测序，同时也提供了生殖细胞突变或体细胞突变检测的实验设计准则。
Ion Torrent 技术
Ion Torrent已经发布了一个商业化的仪器——1个新的半导体芯片——直接将化学信号转换成数字信号。该仪器的第一个技术应用就是进行DNA测序。该仪器充分利用了几十年的半导体研究成果，在短短几年内就给整个的工业设计、制造和供应链基础设施带引入——1万亿美元的投资空间——迎接测序的挑战。 该挑战带来的结果就是Ion半导体测序，第一个不需要光学系统的商业测序仪，且提供了一个前所未有的测序速度，扩增规模和低成本。该技术在几个月内将测序规模从第一代含有一百多万个微传感器的Ion 314芯片扩展到七百多万个微传感器的二代Ion 316芯片——所有的运行时间都保持在1到2个小时之内（图1）。
1. Ion 314芯片 该芯片灰色的椭圆形区域包含着一百多万个半导体微孔，这些微孔接受并记录测序的反应结果。
图2 Ion Torrent测序芯片单个微孔横截面的示意图。 孔内容纳的是含有模板DNA的离子微球颗粒。当合成一个核苷酸，就释放一个质子，微孔的pH值随着改变。离子传感层检测 pH的变化，并将化学信号转变为数字信号。
该测序的化学反应非常简单。一般地，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个质子，导致局部可被检测的pH值变化。每个Ion Torrent半导体微孔测序芯片中含有将近一百多万个DNA分子拷贝。Ion PGM测序仪按照一个核苷酸接一个核苷酸的微芯片流测序。在一个特定的微孔中，如果模板DNA分子上的一个互补的核苷酸被合成，微孔就会释放出一个氢离子。然后溶液的pH值改变并被离子传感器检测到，基本上直接将该化学信号转变为数字信号（图2）。如果DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。如果模板上的下个核苷酸与微芯片流的核苷酸不匹配，则检测不到电压，也不会记录碱基。因该法是直接检测DNA 合成，不需要扫描，摄像机，荧光等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。
工作流程
Ion Torrent个人基因组测序仪的操作流程非常简单（图3）。第一步是产生两端有Ion Torrent接头的测序DNA片段的文库。这一步可以通过直接将接头固定在PCR产上或者在设计PCR引物的时候直接在引物的5’端加上Ion的接头序列来实现（图4）。
图3. Ion Torrent测序工作流程示意图。 生产两端含Ion Torrent测序接头的DNA测序文库片段。将文库片段克隆到离子微球颗粒上并进行乳液PCR扩增。将含有扩增模板的离子微球颗粒应用到Ion Torrent的芯片上，然后将芯片放置在Ion PGM上。设立Ion PGM测序运行程序。测序结果以标准的文件格式显示。下游的数据处理可以用Partek ® Genomics Suite ™系统的DNA测序数据分析工作流程进行分析。
图4. 生成测序文库的PCR扩增引物结果。可以用标准的引物设计软件设计引物，如Primer3.根据选择的特定物种模板序列时使用。
然后，文库的片段被克隆到专门的离子微球颗粒上，再通过微乳液PCR进行扩增。将表面带模板的离子微球颗粒转移到Ion芯片，通过短暂的离心将离子微球颗粒沉淀到芯片的微孔中，接着放到个人PGM仪器上按触摸屏上的操作导引建立程序运行测序。
Ion文库片段试剂盒使用说明书，Ion 314模板试剂盒使用说明书，Ion 314测序试剂盒使用说明书。各说明书上有相应工作流程详细的步骤说明。
数据一旦在Ion PGM测序仪上产生，仪器会自动将数据传送到Torrnet测序的服务器上。在该服务器上，数据通过信号处理和碱基算法分析，产生单次读长的相关DNA序列。Torrent用户网页上有一些实验数据的总结，这些数据的结果可以供用户浏览和下载，数据文件格式为SFF，FASTQ或SAM/BAM。这些Ion Torrent的测序数据可以被多种NGS数据分析系统识别。这篇文章的数据分析描述是以Partek基因组分析系统为例子的。
实验设计注意事项
为了要得到最理想的扩增子测序结果，需要考虑以下几点：
•双向或者是单向测序
•测序目标区域的长度
•测序覆盖深度
一般我们推荐选择双向测序，双向测序可以产生高质量的测序读长，因为双向测序可以分别从两端读取扩增子的全长（相当于进行了两次测序）。双向测序的方法要求每个目标区域包含4个融合引物，两端的任何一个接头序列都必须融合到特异的目标区域两端。两对融合引物中的其中一对，靠近目标区域的近端含有一个A接头区域，而目标区域的末端含有P1接头区域。另外一对融合引物将会含有A和P1接头的交换区域（图5）。单向测序只需一对融合引物就可以从扩增子的一端扩增整个片段。
图5. 如何选择恰当的靶序列DNA特异引物进行乳液PCR扩增构建用于双向和单向测序的扩增子文库示意图。双向测序需要生产两个模板，需设计两对引物，而单向测序只产生一种模板，只需设计一对引物。
为了获得最佳的测序结果，必须慎重选择靶序列区域的长度。而目前的单次读长为100碱基。然而，片段开头的20-25个核苷酸序列与靶序列PCR引物对应的序列将不会产生信号数据。因此，我们目前的靶序列（有信号产生的扩增子区域）长度约为75个核苷酸。该技术正在快速发展中，随着单次读长的增加，将进一步打开大片段扩增子的研究大门。双向测序可以获得更长的片段（约为150个核苷酸），且序列的两端读长不会重叠。
覆盖的深度是用来确保足够的统计置信度，以便作出准确的突变预测，其范围也将决定样品的预期突变频率。实验所需的覆盖深度也将决定扩增子的数量，该数量包含于每张芯片固定的测序通量。作为指导，我们应该考虑两个不同的使用情况，即所需的覆盖深度范围和单次测序的扩增子读长。
1、对于遵循标准孟德尔遗传模式的种系突变分析，预期在100%或是50%的测序读长中含有一个给定的序列变种。这种情况遗传性疾病如囊性纤维化（CF）、家族性癌症、智力低下、发育性疾病等方面比较常见。在这种给定序列变种的均质细胞系中，覆盖深度为100-200X的范围可提供检测统计置信度所需的足够数量的读取数据。Ion 314芯片提供的覆盖深度可满足500个扩增子双向测序所需的序列读长（图6）。Ion 316芯片的测序通量是Ion 314芯片的10倍，因此每张芯片可以测更多的扩增子或是更复杂的样品。样品的多元性测序是利用分子条形码来实现的，该分子条形码是一组独特的序列（通常为6-10个核苷酸长），该序列是每次读长的一部分，可以用来鉴定一个给定样品相关的所有读长。Ion Torrent公司目前正在构建与Ion Torrent测序平台兼容的分子条形码。
图6. 两个扩增子事件说明覆盖深度与扩增子数量之间的相关性示意图。生殖细胞突变检测，要求中等覆盖深度；体细胞突变检测，要求更高的覆盖深度，因为在同样的运行情况下，结果显示，体细胞突变能够测序的扩增子数量较少。Ion 316 芯片每张可以容纳更多的样品或增加每次实验的扩增子数量。
2、在混杂的癌症样品中，多种类型、低频率的体细胞突变检测一般需要比较高的置信区域，其必须的更广覆盖深度范围为1000-2000X。在该覆盖深度，Ion 314芯片提供的通量完全足够50个扩增子的双向测序读取（图6）。Ion 316芯片提供了更高的通量，其覆盖区域可以满足更大数量扩增子的测序或是频率更低的变异体检测。
DNA突变的鉴定
碱基数据一旦生成并且与Torrent服务器上的参比DNA序列比对，然后SAM（序列比对格式）的数据文件可以直接导入Partek® Genomics Suite ™ (GS)基因组分析系统进行后续分析。该基因分析体统会按照预先设定的工作流程进行各种分析。在DNA测序的工作流程中，多种样品的分析是一个以循序渐进的方式产生Ion Torrent扩增子测序数据的过程。该进程是用户以一个合乎逻辑的方式将SAM文件（PGM每次运行所得数据）步进导入Partek® GS数据分析系统。数据是按照复制结构来分组的，不管是生物合成或人工合成的复制数据都可用。由于覆盖区域的差异，跨越几个短的扩增子内也会发生，系统则认为该数据种类是正常的，野生型样品与实验样品数据的分析是平行运行的。Partek® GS系统实行这样的统计检测，比较实验样品的碱基对组合与野生型正常样品碱基对组合的基本差异。扩增子上每个碱基的检测统计P值是按照以下的定义产生的，即如果变异存在，那么检测到的变异的概率应该是随机的。图7以图形方式显示的结果是根据导出的数据表产生的。该图可供科学家查看所发现的突变位点（根据P值判定）具体的基因组位置和每个突变位点附近相关序列的覆盖深度区域。通过对基因组位置进行的统计检测，可以在找到的显著突变范围中删除一些不确定的突变选择。
图7. 均质细胞系内跨BRAF基因区域的DNA突变鉴定。顶部——图示窗口显示了BRAF基因序列内其中的22个碱基对。紫色的垂直线表明了26位点上高突变频率（P值检测的负Log函数值）。灰色区域显示的是Ion Torrent测序覆盖深度（约140X）区域。该突变是BRAF基因1799位点上T替换A的事件。样品中几乎100%的读取都测出了这种突变，表明它是同质细胞系样品内的纯合突变。底部——彩条显示了Ion Torrent定位的覆盖区域读长的碱基排列顺序。根据底部图例，每一种颜色都对应表示4种核苷酸的其中一种。
总结
扩增子测序是NGS测序技术中应用增长最快的一种，特别是在临床研究的相关领域。扩增子测序在基础研究方向也有广泛的应用，如追踪全基因组研究中鉴定的感兴趣区域，重要的信号通道研究等。本文详细说明了Ion PGM测序仪在生物基因相关区域，生殖细胞突变或体细胞突变的检测应用。 我们提供了扩增子测序运行的完整实验设计及工作操作流程准则。通过专门的扩增子测序的统计检测分析，Partek®GS系统扩展了其在DNA序列数据分析的通量。该分析软件不但提供了突变事件统计计算的置信度，而且还以直观的图形显示突变位点在基因组的位置、覆盖深度和突变事件的概率。这些结果可直接保存或以各种公认的高质量文件格式导出。 相比之下，简单的Ion Torrent测序技术不超过2小时就能完成其它NGS测序技术需要几天或是数周才能完成的工作。该技术结合了基础化学和半导体的检测技术，无需成像和荧光检测，也不需要成像相关的摄像机或扫描图。 由于芯片就是测序的主要仪器，因此该测序技术有极大的可扩展性。Ion 316芯片的测序通量是Ion 314芯片的10倍。更多的通量允许样品以多条形码的方式研究，极低频率突变的判定是每次运行测序时通过对异构样品的检测或是分析更多数量的扩增子来实现的。只需购买一台仪器设备的，用户可根据不同的实验要求选择不同级别的测序通量。此外，不久的将来，随着测序读长的延伸，可以对更大的扩增子进行测序。Ion Torrent公司已经成功的将单次测序读长提高到200个核苷酸。 Ion Torrent介绍了非常适合扩增子测序的一种革命性的技术。它是一种经济、快速、简单、规模可扩展，极具前瞻性的测序技术，也是各种不同规模的实验室想要进行高通量测序的完美选择。
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