靶向DC细胞的治疗型肿瘤疫苗：亮点与挑战并存
2006年6月，第一个肿瘤疫苗Gardasil获得美国FDA批准，用于宫颈癌的预防。成功不是偶然的，因为宫颈癌是HPV泡疹病毒引起，用泡疹病毒的特异蛋白作抗原，刺激机体产生抗病毒抗体，疫苗才有预防作用。一个疫苗的成功与否，与是否有一个适当抗原休戚相关。可惜的是，肿瘤的发生除宫颈癌可以归罪于単一的泡疹病毒以外，其它肿瘤并非单基因病变，所以抗原难以确定。有一点大家都心知肚明，特异的肿瘤抗原几乎没有，肿瘤相关抗原倒是有好些。鉴于肿瘤是多基因病变，目前的肿瘤疫苗多致力于肿瘤治疗而不是预防。用通过激活自身免疫能力来达到治疗肿瘤的策略已经出现了几十年，肿瘤疫苗从理论到实践也走过很長的时间，但临床疗效还不尽人意。随着人们对树突状细胞（Dendritic cell）及其生物功能的进一步了解，治疗型肿瘤疫苗渐渐走入实用阶段，或许成为将来治愈肿瘤的希望。
树突状细胞（DC）的发现是最近几十年来免疫学里程碑式的成就，也扮演着从Innate 免疫（非特异性）转向Adaptive 免疫（特异性）的枢纽。而DC的发现者Ralph Steinman 也获得2011年诺贝尔奖。树突状细胞最吸引人的地方是能够将抗原吸收，处理，并表达到细胞表面，让T细胞识别并激活，从而杀死带有这种表面抗原的细胞（如病毒感染细胞和某些肿瘤细胞）。目前肿瘤疫苗的一个共同思路是让树突状细胞吞噬肿瘤相关抗原，通过其细胞内的处理，将以小分子肽（9-10个氨基酸）的方式在细胞表面形成人类白血球抗原（MHC2）。而T细胞的CD8可以识别树突状细胞表面的MHC2，从而杀死表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。
2010年获得FDA批准上市的Provenge就是以上策略的最好诠释。第一步是确定肿瘤相关抗原：研发Provenge的公司Dendreon是以分离树突状细胞技术起家的。对于前列腺癌来说，PAP（prostatic acid phosphatase）在晚期前列腺癌病人的前列腺表达较多。Dendreon公司的科学家巧妙地把肿瘤抗原PAP与一个叫GM-CSF的因子融合在一起。GM-CSF的作用就是促进树突状细胞的扩增与分化成熟，没有GM-CSF的作用，树突状细胞就不能把肿瘤抗原有效地表达到细胞表面，并让T细胞识别。Provenge这个疫苗不是传统意义上的疫苗。传统的疫苗是接种一次或几次，而Provenge更象流程，首先提取患者的外周血，清除红细胞，剩下的白细胞（含dendritic cell和T 细胞）与PAP/GM-CSF培养36-44小时。在这个过程中树突状细胞把肿瘤抗原PAR吞噬，并在GM-CSF的作用下分化成熟，把肿瘤抗原的片段以MHC2的方式让T细胞识别。再把这个处理过的白细胞会输给病人，激活识别PAP肿瘤相关抗原的T细胞去杀死前列腺癌细胞。在超过三百试用者参与的3期临床实验中，Provenge联合化疗比对照组(病人外周血白细胞未经过PAP/GM-CSF处理加化疗），病人的总生存期延长了四个月。这个靶向树突状细胞的治疗性肿瘤疫苗获得FDA批准是肿瘤免疫疗法的一个亮点。
到目前为止，大部分报道的靶向树突状细胞的治疗性肿瘤疫苗通常包括三个组成部分。i）肿瘤相关抗原：抗原可以是小分子肽，重组蛋白。经历改造修饰的肿瘤细胞，病毒载体/或改造过的细菌载体來表达的肿瘤抗原，和DNA或者RNA。这些不同方式表达或制备的抗原可能在体内被树突状细胞吸收和处理，并以MHC2表达到细胞表面，可以被T细胞CD8识别。抗原也可以直接表达在树突状细胞上。2）是树突状细胞（体内的，分离提纯的，或是分离在外周血白细胞中的)。第三个成份为佐剂或免疫剌激剂，比较新的有Poly-ICLC（主要成份：羧甲基纤维素，聚肌胞苷酸，多聚赖胺酸双股RNA,可以激活Toll like receptor3 。激活Toll like receptor3可以激活非特异性免疫)。第三个成份非必须，有人用，也有人不用。Provenge就不含佐剂。
如何让抗原被树突状细胞吸收和处理？一种方式是静脉输入抗原，假设抗原进入体内，这些抗原会被树突状细胞吸收和处理；另一种更常见的方式是让抗原与树突状细胞在体外充分作用后再回输给患者。给药方式可以是静脉，皮下，或直接注入到肿瘤上。
从临床试验的官方网站上，肿瘤疫苗的注册临床实验有1667个，光三期临床就有156个。客观的说，如果没有二期临床的阳性结果，恐怕也不敢冐险上三期，但如果认为有156个三期实验在进行着，一个肿瘤疫苗丰收的季节已经来临，那也过于乐观。只是粗粗的看看这些实验，亮点不是太多，因为许多的核心问题在这些设计中并没有得到充分觧决，肿瘤免疫的几个难坎并未翻越，所以要有審慎的乐观。目前的光景有点象五八年大炼钢铁，每家都搭个炉灶，用自己的方法（但客观上并没有统一的方法）,各炼各的钢，但炼成钢还是废铁，就天知道。因为材料、程序和火候都至关重要。
早期的肿瘤疫苗简单地把肿瘤相关抗原以小分子肽的方式直接输入病人，恐怕这些多肽还没有激活免疫系统就已经被机体清除掉了。后来有人把肿瘤抗原小分子肽与白细胞介素2一同给药，这样可以增加免疫反应，但临床疗效还是有限。也有人把小分子肽从10到12个氨基酸（MHC II），加長到20个氨基酸，并配以树突状细胞的佐剂以提高免疫反应，临床效果也并不太明显。目前，有人干脆就把肿瘤相关抗原加佐剂输入病人，这样，也许被树突状细胞处理过的多肽表达到细胞表面以激活T细胞对同一抗原的反应。GSK的代号为MAGE -A3三期临床试验一共招募了2500黑色素瘤患者。但这个三期实验并未达到延长总生存期的临床终点。有180参与的二期临床尽管延长生存期，但不具有统计学差异。核心问题是：如何证明肿瘤相关抗原按预想的以MCH 2 的方式表达在树突状细胞表面？而且为何在血清中并没有测到T细胞的反应？临床试验是失败了，但后人可以吸取一点教训，核心问题不解决，光胆大是不够的。
人们对启动树突状细胞也动了不少主意，有人把病人的B细胞淋巴瘤体外表达肿瘤相关抗原，配以GM-CSF(树突状细胞分化成熟剂）来达到启动树突状细胞继而激活T细胞，三个三期临床试验，尙无佳音。有人想到病毒载体。好处是病毒可以带不止一种蛋白，肿瘤相关抗原，免疫粘附因子，再加GM-CSF, 作为一个更为系统的疫苗。这个方案在二期临床显示出对总生存期的效果，但是还要在三期临床验定。其实核心问题还是没有解决，病毒的药代动力学如何控制？多次给药之外，病毒在人体中如何与树突状细胞反应？抗原如何被树突状细胞表达？
从细胞生物学的观奌，GM-CSF是树突状细胞分化成熟必不可少的因子，如果長期刺激树突状细胞分化成熟，肯定可以提高非特异性免疫力。GVAX 就是这样的细胞，可以持续不断的分泌GM-CSF, 但单单用GM-CSF 是不够足以治疗肿瘤的。湾区的第一个以GVAX 细胞治疗肿瘤的公司，因前列腺癌单用GVAX的三期临床试验无法延长总生存期的临床终点而关门。
有一个肿瘤疫苗設计方式吸引了不少同行的高度关注。李斯特杆菌是一个高毒性致病菌。病菌进入人体后，病菌会进入肝脏，引发严重的炎症反应。这些激活的细胞中，有T细胞和树突状细胞。经改造的李斯特杆菌，把两个巨毒致病基因去除后，仍然能激活基础免疫(T细胞和树突状细胞），可以是一个有效的抗原载体。湾区的一个生物制药公司，把一个胰腺癌的相关抗源MUC1用改良型李斯特杆菌用基因工程的方式表达作为疫苗，并辅以GVAX确保有足够的GM-CSF来促进树突状细胞的分化成熟。因为改良型李斯特菌本身能刺激树突状细胞和T细胞，这个想法在一个二期临床实验上得到可以引起重视的效果。不能手术的胰腺癌病人一般生存期约六，七个月，而单方化疗约可以达到七，八个月生存期，复方化疗可以达到八，九月的生存期（但副作用是很难耐受的）；如果用过一次化疗不成功，再使用第二个化疗方案，生存期约三，四个月。在以改良型李斯特杆菌制备的疫苗病人中，均是使用过一次化疗并不成功的病人。预期生存期约三到四个月。而疫苗组病人达到六个月的生存期。可惜这个临床设计有明显缺䧟，没有很好的对照组（如改良型李斯特杆菌不加肿瘤抗原），所以疗效分析尚不肯定。但瑕不掩瑜，可以说，这是个很有创新的思路。
在众多的肿瘤疫苗设计中，有人注意到了肿瘤抗原如何被树突状细胞吸收的问题。大多的肿瘤疫苗设计方案都忽视这个问题，似乎把肿瘤抗原一给，想当然树突状细胞照单全收。这个想法未免有点天真。树突状细胞对蛋白的吞噬是一个受体介导的过程，而且用于蛋白介导吸收的受体有十几个，那么不禁要问，难道任何肿瘤抗原都会被树突状细胞有效吞噬吗？如果不能，又如何把抗原小分子肽以MCH 2 的方式表达出来去激活T细胞？目前，终于看到有人来试图来觧决这个问题。用针对树突状细胞表面受体DEC205为靶点的抗体联接一个肿瘤抗原，在细胞水平可以看到抗原表达量大大提高的证据。可见，还是有人能不随大流，愿意静下心来做一些艰苦的探索，而不是心浮气躁的大干快上。
从目前发表的文献中和临床试验的结果看，治疗性肿瘤疫苗的设计是八仙过海，各显神，但总的说来，失败的多成功的少，而且成功还有某些运气成分。目前只有Dendreon 的思路获得肯定，那就是把病人的外周白细胞与肿瘤相关抗原和GM-CSF直接体外作用，再把处理过的白细胞给回给病人。从药代动力学来说这个方法比前述的其他方法有以下几个优点1）抗原与树突状细胞作用的时间与浓度更有保证；2) 树突状细胞如果能把肿瘤抗原经过处理表达到自身的表面，也有更髙的浓度与时间与T细胞作用，而且不必自己寻找在外周血循环的T细胞，也不要泳到肿瘤旁与T细胞作用。正是这些优势，导致了provenge获得FDA批准为第一个用于前列腺癌的治疗疫苗。但是，既便是有临床疗效，还有不少问题没有弄清楚：1)抗原被病人自身的细胞处理得怎么样，表面表达如何？时间是否优化？细胞与树突状细胞中T细胞的作用时间够不够？多少树突状细胞是合适的？给几次合适？为什么临床看不见肿瘤缩小？总生存率似乎与血淸中的T细胞的反应无关；PSA，一个重要的临床效应指标，竟只有不到3%的病人有下降50%的临床反应。所以这个肿瘤无进展生存期延長是如何获得的？也许是什么我们目前还不明白的机制。
三十年磨一剑，不敢试锋芒，恐怕再磨十五到二十年，肿瘤疫苗会有个全面丰收的季节，但这个良辰美景到来之前，有以下的挑战要解决。
这些挑战首推肿瘤相关抗原，每个肿瘤、每个亚型、每个肿瘤分期，这些相对抗原表达是不一样的，所以选准抗原,选准病人人群是致关重要的。第二，如何达到肿瘤抗原在树突状细胞中髙效吸收与表达？抗原被树突状细胞吸收是以表面受体为介导的。树突状细胞有十几个受体，如何根据特定的抗原选择相应的受体?目前有人用针对树突状细胞表面受体抗体介导的方式来增加肿瘤抗原的收拾与表达，这是一个很好的开始。但肿瘤抗原被树突状细胞吸收后的表达还有具体的细胞生物学机理要觧决。肿瘤抗原在 lysosomes 中的处理, 在Endosomes的修饰转运的方式，这个过程与的分化息息相关。肿瘤抗原以小分子肽MHC2表达到细胞表面,这个过程如何调节？第三，针对树突状细胞分化成熟的调控。树突状细胞的分化成熟是一个非常复杂的过程，它既可走向激活T细胞也可以走向抑制T细胞.如今GM-CSF是公认的可以促进树突状细胞分化成熟的因子，但还有许多不同的体内因子，如TNF、TGF、IFN、 IFN， 白细胞介素 6,10,12等可以把树突状细胞引向为免疫激活或免疫抑制。如果这个条件不能控制，我们假想的治疗性肿瘤疫苗可能做我们希望相反的工作。第四，肿瘤疫苗设计如何争对树突状细胞的亚型。在目前的认知中，血液中有三种亚型BDCA1、BDCA3、和 PDC；皮下有两种 LC和CD14，而且每一种亚型的生物功用是不一样的，介导的免疫反应也不一样，与T细胞亚型的作为也不一样。在搞清这些亚型的生物作用后，新一代争对树突状细胞亚型设计的治疗性肿瘤疫苗才能选准方向。
最后一个坎也是最难过的坎，是把肿瘤微环境引入这个话题。晚期肿瘤，已经对自身免疫系统造成了许多的攺变，从细胞水平来说，Myeloid derived suppressor cells (MDSCs), Regulatory T cells (Treg), Type II Natural killer cell (NKT2), Macrophage type 2都扮演着免疫抑制的作用；从体液水平来说，TGF、 白细胞介素1, 10,17, 均抑制免疫反应。其中TGF、白细胞介素10，均引导树突状细胞向免疫抑制的方向发展。
笔者认为，这些问题都会在新一代以以树突状细胞为靶向的治疗性肿瘤疫苗的设计中应对和解决。尽管挑战很多，但解决的方式必须简捷，因为用在病人身上的治疗性肿瘤疫苗必须简单易用。以笔者乐观的估计，在未来的10 到15 年，治疗性肿瘤疫苗将迎来一个丰收的季节，在以小分子制药遇到瓶颈的时候，无论从制药厂家还是基础研究，争对树突状细胞的合理应用都是当今的研究开发的重心。
