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[论坛]各种LCMS的比较
dingdang 发布于 2007-08-01 16:19:48
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内标和外标是什么及其选用
firefox 发布于 2007-08-10 23:45:56
来源：仪器信息网
--------------------------------------------------------------------------------An internal standard should be used when performing MS quantitation. An appropriate internal standard will control for extraction, HPLC injection and ionization variability. In a complex matrix it is not uncommon for two different standard levels in SRM integrated plots, at the lower end of the standard curve, to give nearly an identical response. It is only when an internal standard is used that the two points can be differentiated. Some researchers attempt to prepare standard curves and run samples without an internal standard and find moderate success. Often without an internal standard % RSDs of replicates can be as high as 20%. Using an internal standard the % RSDs can be brought down to approximately 2%. We run triplicates at each level of our standard curve.
How do I choose an internal standard?
The best internal standard is an isotopically labeled version of the molecule you want to quantify. An isotopically labeled internal standard will have a similar extraction recovery, ionization response in ESI mass spectrometry, and a similar chromatographic retention time. If you are performing non-clinical PK quantitation it may be difficult to justify such a standard since a special synthesis of an isotopically labeled standard can be expensive and time consuming. Often if you are working with medicinal chemists they will have a library of compound analogs that can be used as internal standards. These analogs were made in the evolution of the compound to be tested and will be similar to the compound to be quantified and more importantly will be slightly different by parent mass. Try to avoid using de-methylated (-14) or hydroxylated (+16) analogs as internal standards since these are the most common mass shifts observed in naturally occuring metabolites of the parent compound. A common internal standard is a chlorinated version of the parent molecule. A chlorinated version of the parent molecule will commonly have a similar chromatographic retention time which is an important characteristic of an internal standard. We have found that one of the most important characteristics of an internal standard is that it co-elutes with the compound to be quantified.
How do I use an internal standard?
First of all an internal standard should be added at the beginning of the sample work-up, typically before the plasma crash or solid phase extraction. The internal standard should be added at the same level in every sample including the standards. An internal standard should give a reliable MS response. Care should be taken that the amount of the internal standard is well above the limit of quantitation but not so high as to suppress the ionization of the analyte. "How much internal standard should I add?", this is an important question. It pays to know roughly how much compound is in your sample. This can be accomplished by making trial analyses of an early, middle and late time point with perhaps one or two standard points. This information will be very valuable when building an appropriate standard curve and in knowing how much internal standard to add. If you were trying to quantify samples in the range of 100 fg to 25 pg and the limit of detection was 100 fg you might add 5 to 10 pg of internal standard to every sample. A good rule of thumb is to target the internal standard to the lower 1/3 of the working standard curve. This is a range that will give a comfortable response without interfering with the ionization of the analyte.
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中文：
什么叫内标法?怎样选择内标物?
内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。
内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?
影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。
化学方面的因素包括：
1、内标物在样品里混合不好；
2、内标物和样品组分之间发生反应，
3、内标物纯度可变等。对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，
在制作内标标准曲线时应注意什么?
在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。
外标法
用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。
外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：
W＝A(W)／(A)
式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。
外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。
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定量分析中怎样选择内标法或外标法
选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。
内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。 内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。 外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。
内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。
1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没有自动进样器，用外标法定量，确实重现性与稳定性非常差，结果经常受到搞合成同事的质疑。其实，仔细分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析，首先我们的实验室仪器和手段是否调整到一种稳定而合理的状态了，比如，衬管是否洁净，玻璃棉的位置是否合适恰当（能否使样品尽可能的汽化）、汽化温度是否合适、色谱峰形是否对称（也就是样品与色谱柱健合相是否匹配）、附近有没有其它色谱峰的干扰、选用什么进样方式（如快速进样还是热针进样）等等因素的影响都需要考虑，如果这些因素都考虑了，按照GMP方法验证对于精密度的要求，同一样品进6针以上的RSD和配制6个样品的定量结果RSD都能满足小于1.5%的要求，那么这个方法用外标法就是完全适用的，但是前面的影响因素是一定要都考虑到的，否则谈论这个方法是否适用就有失偏颇了。在做过的许多出口产品的定量分析方法当中有许多是一些医药公司提供的比较完善而验证过的方法，内标与外标都有（他们用的都是自动进样）精密度都能满足RSD小于1.5%的要求，当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内标外标，都是可行的，当然有一个分析成本和分析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制当然要比外标要高和麻烦一些了。而有些时候，可能受你实验室现有仪器和附属设备的影响，达不到一定的要求，而还必须进行定量分析，有时外标的结果可能就要差一些，这时，你可能就要考虑用内标法了，可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知因素平行误差的影响，这时内标可能就显示出它的优势来了。
2、上面已经提到当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样品溶液用所选用的外标法进行定量的时候，RSD都满足1.5%的要求时，也分为两种情况，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这个方法就没有什么可以怀疑的了；如果RSD的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这个方法的可行性就将受到质疑，毕竟这是方法验证，你就要考虑上面1所提到的影响因素的影响了，如果排除掉以上的影响因素，RSD还是在1.5%附近，就要尝试内标了，如果内标结果的RSD很好，就证明你的这个方法受实验条件的影响很大，只能用内标了，或者干脆将原方法做大的变动，再尝试用外标法测试。
3、而对于微量分析，比如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的限量标准要求对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多，RSD有时可以允许达到10%甚至更高，这时可能外标法有更大的应用空间。
4、单从精密度方面去考虑，排除其它成本和效率的因素，个人认为还是内标优于外标。曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，RTX-5 amine（碱改性） 15m*0.32mm*1.0um色谱柱分析，将配制好的控制溶液（含有内标物）自动进样器进6针，目的物（二氨基丙醇）与内标物（二乙醇胺）峰面积比率的RSD为0.18%，而只对这六针样品的目的物峰（二氨基丙醇）面积求RSD，结果为0.71%，通过这一实例的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了，当然是内标更好了。当然这个化合物的检测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的，实验室可以自由选择。但内标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。
结论：应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下，用内标法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。
外标法
用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。
注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。
在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
在完全相同的实验条件下，注入未知样品，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。外标法的优点：
操作、计算简单，是一种常用的定量方法。
无需各组分都被检出、洗脱。
需要标样。
标样及未知样品的测定条件要一致。
进样体积要准确。内标法操作：
将已知量的内标样加入标准样品，制成混合标样，并配制一系列的已知浓度的工作标样。混合标样中标样与内标样的摩尔比不变。
注入色谱柱，以（标样峰面积/内标样峰面积）为响应值。
根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
将已知量的内标样加入未知样品，注入色谱柱，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。内标法的特点：
操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。
内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。 -
液相色谱-质谱联用系统用于小分子化合物分析时的几点体会
mass 发布于 2007-08-19 00:00:59
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介绍几本质谱解析的专著
snow_white 发布于 2007-08-26 12:04:43
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基质效应
troy.tper.lee 发布于 2007-12-14 09:23:19
基质效应问题一直是我们遇到的大问题，我这方面懂得也不多，建议：
1）最好是优化前处理方案，从根本上解决基质效应问题。如果是液液萃取，改用提取效率更高的提取剂；如果SPE估计关系不大；如果蛋白沉淀，更高的沉淀或稀释倍数，一般不建议改用无机盐，但得根据实际需要。另外，牵涉灵敏度能否达到的问题。
2）优化色谱条件，一般的基质抑制主要是前沿峰里的混合物质，最好是检测物与前沿峰完全分离。当然了，可以增加一些提高信噪比的物质，这些需根据离子化加合的物质选择。也可以使用梯度洗脱，既可以减少前沿基质，又能提高信噪比。
3）当然了，有些仪器可以通过特殊的方法专门考察一下基质效应所引响的区域，从三通阀处用针泵恒速进样检测物，用液相进样含基质的空白基质处理液，检测会看到基质抑质的倒峰。
4）优化离子源参数，以实际响应的提高为标准。
5）对于内源性基质抑制就很难处理了，要一步步去寻找根源和减少抑制。
我最近遇到内源性物质（估计是代谢物）对自身的影响，很难办，出在头痛中。希望大家多出主意！
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质谱相关网址
mass 发布于 2008-01-04 23:29:59
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代谢组学分析技术及其在几类重大疾病研究中的应用
wkh 发布于 2008-03-19 21:34:50
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上传了几个agilent 的资料
白云碧落 发布于 2008-05-29 18:42:48
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改进和简化的液相色谱／大气压化学电离化质谱方法分析多种食品中的未衍生化的游离氨基酸
UUBird 发布于 2008-06-17 11:19:40
引言
按照官能团或“R”基团分类，共有22种氨基酸。22种氨基酸中的8种是必需的，它们是组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸，即意味着人类必须从饮食中摄取一定的量以保证功能正常。对于食品工业，由于营养标注的需要，氨基酸的测定非常重要。
一些氨基酸的测定方法基于柱前或柱后衍生化技术，已被证实能够获得很好的结果，但是存在分析时间长或重复性差的缺点。其它用于氨基酸测定的多数方法都涉及氨基酸衍生化之后或之前的UV吸收或荧光官能团检测的色谱分离。尽管这些方法比传统的需要在茚三酮和OPA衍生化后定量的离子交换方法快一些，但仍非常耗时，需要20至75分钟，并且重复性差，难以操作。
当前的研究目的是：1) 研究用于不同食品中22种游离氨基酸测定的简便、快速、准确和可重复的LC/APCIMS方法；2) 研究一种简单且无需净化的氨基酸水提取法；3) 用窄径柱以较短的运行时间进行筛查和定性定量分析。
实验
LC/MS实验是用包括二元泵、自动进样器、柱温箱的Agilent 1100系列HPLC系统配上装有大气压化学电离源(APCI)接口的Agilent 1100 MS检测器进行的。
以选择离子(SIM)模式进行数据采集，接口参数为：干燥气(N2，100 psig)流速4L/分钟，雾化器压力55 psig，干燥气温度320℃，汽化室温度425℃，毛细管电压3千伏，电晕电流8 μA，碰撞诱导解离压力55伏，驻留时间27毫秒。监测到的22种未衍生化的氨基酸离子见表1。
色谱分离在ZORBAX Bonus-RP窄径(100 mm × 2.1 mm,3.5 μm)色谱柱上进行，以含有0.01 mM乙酸的0.2%甲酸水溶液为流动相在400℃进行等度洗脱，流速为0.2 mL/分钟。
样品分离
根据样品基质，对样品进行研磨（使用混合器，网眼大小2 mm）或混合（使用Ultra Turrax）。干燥样品如婴儿食品、早餐谷类食物和饼干被研细，软样品如西红柿、液体样品如果汁，使用Ultra Turrax混合器混合。每种匀浆样品在样品制备前测定pH值。匀浆后的样品置高密度聚乙烯瓶中加盖塑料旋盖在-20℃保存。称取研细或匀浆样品（鲜重1 g）至10 mL具塞离心管中。用涡流混合器混合2分钟，混合物在-5℃以5,000转离心5分钟。取上清液，定量转移至样品瓶中，如顶部有油层，则应避开油层。在进行LC/MS分析前将上清液用0.45-μm尼龙注射式滤过的过滤。结果与讨论
质谱碎片和色谱条件优化
在两种模式下碎片谱图可重现，对单个质荷比碎片可进行定量。分别将55、70和100 V源内碰撞诱导电离用于所有氨基酸，发现优化条件是55 V和正极性。使用优化的MS参数，所有最大丰度的碎片均出现。在此正离子APCI条件下，SIM-MS分析显示出众的定性和定量条件，整个运行时间在7.5分钟以内。
专属性
质谱检测方法具有对洗脱化合物给出结构信息的优点。此外，共洗脱的化合物能够通过选择监测不同的质荷比离子达到分离。在本次研究中，使用了一种简便、快速而且经济的样品制备方法。通过使用0.2 mM乙酸溶液提取，溶解在水中的胶体（淀粉）在离心时同时沉淀。如果食品样品含有脂肪，低温离心能够将其分离。图1显示同一次进样中得到的青豌豆中22种氨基酸的特征质荷比离子MS信号。
食品样品
本项研究中，分析了22种食品样品的氨基酸含量。食品类别包括婴儿食品、蔬菜、水果、果汁、坚果、葡萄酒、啤酒、牛奶、鸡肉和蜂蜜。每种食品的氨基酸平均含量见表2。
每种食品中氨基酸的含量有很大差异。氨基酸含量的差异可能源于配方组成的差异和／或处理条件的差异。同时蛋白质成分能够增大食品中游离氨基酸组成的轻微差别。提取前测定了样品的pH值，果汁、啤酒和葡萄酒的pH值为2-3；西红柿的pH值约为4；豌豆的pH值约为6；牛奶的pH值约为7。众所周知，氨基酸的测定在许多领域都是极为重要的，例如：
1) 从氨基酸的含量比例确定蜂蜜的地域来源
2) 对婴儿第一个月的营养分析，如是否补充足够数量和质量的氨基酸以满足如此重要阶段的需要
3) 一些重要的游离氨基酸，如天门冬酰胺、谷氨酰胺、天门冬氨酸和谷氨酸，在许多产品中是丙烯酰胺的重要前体
结论
本次研究开发了一种用以测定食品中的22种游离氨基酸的简便、可靠和快速的LC/MS方法。该方法可广泛应用于多种食品。我们的目标是对阳性模式下表现出灵敏度的未衍生氨基酸进行单次运行LC/MPCI-MS分析，并且加以改进，通过使用较酸性LC/MS流动相达到了非常短的运行时间，仅需大约7.5分钟。从样品制备到接下来的色谱运行能在不到25分钟内完成。以前的研究，使用传统液相色谱柱、长时间的提取和净化，以及随后的衍生化分析5份样品预计需要1天时间。而用这种新的简化的快速方法，同样时间可以完成一批20个样品的分析。 -
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aa_tang 发布于 2008-09-26 23:00:31
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智商高的孩子有这些特点
dragon5 发布于 2009-10-26 11:28:54
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详细比较一下常见的质谱性能和特点
amelican_beauty 发布于 2009-12-17 21:14:58
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液质联用的问题
xiaozhu917 发布于 2010-02-06 21:29:22
今天换了个新柱子，但是在走样品的时候出峰时间竟然与以前用的柱子完全不一样，时间推后了，检查了流动相没错，柱子和以前是一个牌子的，不知道什么原因，希望大家来讨论下原因，先谢谢了！
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基线高的问题怎么解决
mexiaoma 发布于 2010-05-11 07:32:19
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离子阱质谱和三级四极杆液质联用系统的区别
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如何检测支链氨基酸（BCAAs）的含量？作为补充支链氨基酸的依据！
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如何检测人体游离氨基酸的含量？
aminogy01 发布于 2010-08-02 09:20:51
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一些好东西，都是大家需要的，奉献给大家看看……
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kaixinyike 发布于 2015-09-14 23:13:47
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[论坛]12日讲座【食品科学中的组学策略与应用前沿】
xgl4226 发布于 2015-11-11 09:25:16
