高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。采用微柱液相色谱系统可以减少溶剂的消耗并达到快速分离之目的。

高效液相色谱法的主要分离机制有吸附、分配、离子交换和排阻作用。

1．对仪器的一般要求
所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

（1）色谱柱
最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等因素）以及色谱柱的填充，将直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在150?以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在300?以上的填料。
以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。

（2）检测器
最常用的检测器为紫外吸收检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测物的质量有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物结构均有响应；蒸发光散射检测器属质量型检测器，对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱管制和色谱峰纯度的检查。
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测物的质量呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测物的质量通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。
不同的检测器，对流动相的要求不同。当采用紫外检测器时，所用流动相应至少符合紫外分光光度法（附录Ⅳ A）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。

（3）流动相
由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常不应低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求，可在该品种项下注明。

2．系统适用性试验
色谱中最难分离物质对或与其相关的物质对的分离度和待测物响应值的重复性是系统适用性试验的重要参数。

按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应符合要求；或规定色谱条件下的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

（1）色谱柱的理论板数（n）
在规定的色谱的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2），按n＝5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的效果等），使理论板数符合要求。

（2）分离度 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：
式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1及W2为此相邻两峰的峰宽。
除另有规定外，分离度应大于1.5。

（3）重复性
取各品种项下的对照溶液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子。其相对标准偏差也应不大于2.0%。

（4）拖尾因子 为保证测量精度，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：
式中 W0.05h为0.05峰高处的峰宽；
d1为峰极大至峰前沿之间的距离。
除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。

3．测定法
定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但测定杂质含量时，须采用峰面积法。

（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
校正因子 式中AS为内标物质的峰面积或峰高；
AR为对照品的峰面积或峰高；
CS为内标物质的浓度；
CR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品（或其杂质）峰和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：
含量 式中AX 为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；
CX 为供试品（或其杂质）的浓度；
A′S 为供试品溶液中内标物质的峰面积或峰高；
C′S 为供试品溶液中内标物质的浓度；
f 为校正因子。
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，CS=C′S，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。

（2）外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：
含量 式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。

（3）加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种正文中。
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液中的主成分色谱峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分（通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的RSD应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%）。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。

（4）不加校正因子的主成分自身对照法
当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。
若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量个杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。

        乙腈价格高，特别是HPLC级的价格很高！但是，文献或LC厂家所示的条件，多用乙腈，这是为什么呢？现就此谈谈。

1、吸光度，乙腈HPLC级的小。

         乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC吸收最小（特别是在短波长上小）。所谓HPLC级是除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规格值以内。在UV检测时，产生的噪声小，因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时乙腈HPLC级最适宜。另外，在UV检测中的梯度基线上也是乙腈HPLC级产生鬼峰少，虽然，其他与水相溶性高的有机溶剂有各种各样，但很难能找到比乙腈HPLC级吸收更小的。另外，甲醇的HPLC级和优级，虽然所得的光谱相差不大，但是优级不能保证吸光度，有可能产生偏差，价格也相差不大，所以尽量使用HPLC级。

 2、压力，乙腈低。

         柱内承受的压力，根据有机溶剂的种类或混合比率的不同而异，水/乙腈、水/甲醇混合液的比率与输液压力的关系中，甲醇与水混合，压力增高，而乙腈同样与水混合却并不如此。所以，乙腈在同样的流速下不在柱内加上多余的压力。从上述两项，可以确认使用乙腈的意义。那么，甲醇除了价格以外，还有没有其化优点呢？

3、洗脱能力，一般而言，乙腈较强；但当有机溶剂量接近100%时，甲醇强。

        乙腈和甲醇分别用同样的比率与水混合时，一般情况下，乙腈的洗脱能力强。特别是混合比率低时。从咖啡因和苯酚的洗脱来看，获得同样的保留时间，乙腈的比率只需甲醇的比率的一半以下即可。另一方面，有机溶剂100%或与此极接近时，从胡萝卜素和胆甾醇来看，常常都是甲醇的洗脱能力强。混合比在50：1等较为特殊时，调制的误差大，影响保留时间，或平衡化的时间长，乙腈遇到这种情况时，用甲醇的10：1混合代替乙腈，这样操作方便些。溶剂受温度影响时，不采用容器定量，而采用重量的方法（考虑比重），可使混合比的误差减小。

 4、分离（洗脱）的选择性。

        两者的差异是乙腈和甲醇在分离的选择性上不同。这是由于有机溶剂分子的化学性质（甲醇和乙醇是质子性，乙腈和四氢呋喃是非质子性）不同所致。因此，在用乙腈类不能获得分离时，就试用甲醇类看看！

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　　主讲人：朱桃玉，2006年毕业于中山大学分析化学专业，硕士。先后在广州市质检院，waters公司工作多年，2014年加入赛默飞世尔。在HPLC,LC/MS领域有着丰富的仪器维护和应用经验。

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欧盟GMP/FDA cGMP体系

国际注册杂质专题培训

每个上市药品，都必须符合安全、有效和质量可控的基本原则。其中，安全尤其重要。在药品安全研究中，杂质问题一直是国际认证和国际注册的难点和重点。

近几年，国外药政机构在申报文件审核和制造研发现场审计中，对于药品杂质问题尤其关注。而且，这些机构发布了关于杂质的一系列指南，例如美国FDA、欧盟EMEA和EDQM等。这些指南涉及有机杂质、无机杂质和残留溶媒等；而且随着对药品安全性的关注，国际药政机构开始关注金属催化剂和基因毒性杂质的控制问题。

随着国内药品市场的发展和整顿，国家药典委员会在修订2010版药典时，也开始关注杂质问题；而且SFDA的审评中心也发布了关于杂质研究和控制的相关指南。

本次课程主要讲解美国FDA、欧盟EMEA和EDQM、ICH组织、USP杂质要求、EP杂质要求和中国SFDA以及2010版药典关于杂质问题的具体要求和最新进展；并且结合中国制药企业实际情况和国际药政机构控制思路，详细介绍如何通过物料选择、工艺设计、纯化工艺、分析方法选择来降低杂质水平，并且增强杂质分析水平。

北京赛铭医药科技有限公司（SPH）是一家由中国和德国制药技术专家和制药工程专家共同创建的医药科技服务企业，在API、制剂、生物制品等领域广泛开展业务。为帮助制药企业提高杂质控制技术和水平，更深刻的理解安全性对于药品的关键影响，提高撰写合格申报文件的技巧，赛铭医药技术专家依据德国专家和PDA专家的讲义，结合中国企业实际情况和具体案例，特举办国际注册杂质专题培训。

一、培训对象

制药行业的各岗位管理人员和技术人员，包括但不局限于下列人员：

QA经理/主管、QC经理/主管、注册经理/专员、培训主管/专员、验证经理/专员、生产经理/主管/技术员、国际认证协调员/专员、文件管理员/专员、法规事务经理/专员、分析经理/专员、药品标准发展经理/专员、国际注册专员、生产部技术工程师等。

二、培训目标和内容

1－深刻解读ICH关于药品杂质的指南；

2－密切跟踪ICH关于杂质指南的发展变化；

3－深刻解读EMEA关于药品杂质的指南和指导原则等；

4－密切跟踪EMEA关于杂质指南的发展变化；

5－深刻解读FDA关于杂质的指南和相关政策；

6－密切跟踪FDA关于杂质指南的发展变化；

7－深刻掌握CDE关于杂质的控制指南；

8－密切跟踪CDE关于杂质问题的新要求；

9－掌握杂质问题在申报文件中的描述要求；

10－分析和讨论如何通过工艺设计和生产控制来降低杂质水平；

11-如何在药品标准中体现杂质项目；

12-EP/USP/JP/CHP对杂质的最新技术要求解析

13-欧盟对植物药杂质控制的要求

14-深刻解读金属残留杂质的分析和控制策略

15-深刻解读基因毒性杂质的分析、控制和工艺预防

三、专家介绍和培训方式

本次授课的专家在中国著名制药企业具有10年以上工作经验，经历多岗位磨炼，经验丰富，对国际GMP法规指南和杂质控制技术具有全面深刻的领悟和理解；专家是ISPE会员和PDA会员，经常和国际著名制药行业专家进行深入的沟通和交流；并且担任所在公司的技术总监，大量接触第一线的实际问题，具有丰富的分析问题和解决问题经验。为此课程的准备，培训专家阅读了大量相关文献指南，并和总部专家进行了深入沟通和讨论。

本次授课专家曾参加如下技术指南的审核：

1.FDA Guidance for Industry 《Process Validation: General Principles and Practices》

2.ISPE《calibration management guide》

3.ISPE《cold chain management guide》

4.ISPE《process gases guide》

 

全实战教学模式；

讲解与讨论相结合，并且融合最新国内和国际制药行业案例； 

现场回答互动交流；

密切联系欧美买家审计要求与美国FDA/欧盟EMEA法规要求；

密切结合EMEA检查问题分析和FDA483表和警告信案例；

密切联系国际药政机构最新的法规变化和趋势；

课后及时跟踪辅导。

四、会务事项

1－提供全套培训讲义和资料（该讲义资料根据德国总部专家和PDA专家教材整理，并结合中国制药企业实际案例）；提供培训证书；提供午餐；

2－住宿可由会务组统一安排，费用自理。 

3－培训时间：2010年3月18-3月19号（周四-周五）

   报到时间：2009年3月17日全天

4－培训地址：中国杭州   杭州戴斯大酒店

培训报名联系人：郭小姐

电  话：0311-89270601；(0)13623116829

传  真：0311-85692040 

E-mail：sphb037@126.com

公司网址：www.springpharm.net

QQ：1224861446

MSN:SPH-training@hotmail.com

杭州戴斯大酒店详细地址：杭州市江干区凯旋路451号

行车路线：杭州火车站下车，乘坐528路，到凯旋路北口下车即可，

杭州火车东站下车，乘坐28、Y5、K33、33、31路等，抵达闸弄口新村下车即可。

打车：12元左右。从火车站和火车东站打车均10-15分钟左右

          汽车北站下车：乘坐B支1、516路公交车，抵达闸弄口新村下车即可。

时间：5月26日上午10：00

报名链接：http://www.antpedia.com/webinar/866145.html

【内容简介】
中药化学成分十分复杂，液相色谱是中药分析最为常用的手段，但常规液相色谱的峰容量十分有限，且对含量较低的成分检测灵敏度较低。赛默飞全新Vanquish UHPLC系统，更好的性能结合高分辨质谱技术为您提供前所未有的革命性的色谱体验。
【主讲人简介】
张艳海，赛默飞液相色谱应用工程师，在赛默飞一直致力于液相色谱方面的应用方法开发，主要应用方向为多维色谱分离、online-SPE技术在药物、食品和环境中的应用，积累有丰富的分析经验。