前言

　　多个著名的医学杂志和报纸的许多文章都报导了人类和动物的性发展动态和生殖健康问题，例如精子数量少，生殖器畸形，雄性鱼产卵等等。科学家提到，人造的化学品（例如农药和医学药品）都在扰乱生物的内分泌系统。

　　诸如抗生素、非处方药和咖啡因等化合物从下水道大量地被冲入河流，甚至少量的化合物还进入了饮用水系统。为了监测地表水和地下水中的微量药物化合物，
需要建立有效的样品制备和分析方法。

　　在1999年，美国地质调查局国家水质量实验室开发了相应的分析方法，利用OASIS HLB固相萃取净化，高效液相色谱－质谱技术来分析这些化合物。

　　使用多反应监测（MRM）技术，可以将来自水中的杂质和基质干扰信号降至最低，从而提高信噪比，最后获得目标化合物的最佳定量分析结果。在本应用文摘中，利用固相萃取技术，液相色谱／质谱／质谱分析19个药物化合物（在正离子模式）和11个药物化合物（在负离子模式）。 

实验部分

样品制备步骤

更详细的信息可以参见参考文献1。

　　1. 利用0.7-μm的玻璃纤维过滤器在现场或是实验室将采来的水过滤。

　　2. 抽取1升经过过滤的水，以10ml/min的流速通过固相萃取柱，固相萃取柱的填料数量是0.5克。

　　3. 用6毫升的甲醇洗脱固相萃取柱，然后再用4毫升0.1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱。

　　4. 洗脱液浓缩至100微升

　　5. 加入内标（ISTD）。萃取物最后被定容至1毫升。

校正标样

　　对于正离子模式，准备9点校正：1、5、10、20、40、100、200、400和1000pg/μL。对于负离子模式，准备6点校正：10，20，40，80，400和800pg/μL。

　　正负离子模式的多反应监测参数见表1和2。

结果与讨论

　　图1显示了负离子模式下的总离子流图。负离子模式下，11个化合物的分析时间小于7分钟。使用1.8微米的色谱柱，峰宽一般在0.1分钟。相对于3.5微米或更大粒径的色谱柱，其色谱峰更窄，信噪比更高。

　　如图２所示，某些化合物，如酮洛芬对干燥气的温度很敏感。温度（350 °C）越高，母离子响应强度越低。所以，在负离子模式下，干燥气的温度设置为200 °C。

　　在图3中，发现子离子碎片的质荷比大于母离子。对于阿奇酶素，由于二价离子的响应高于一价离子，因此被选为母离子。因此，根据母离子的选择，有时候子离子的质荷比可以大于母离子，所以扫描范围需要更高一些。

 

　　图4为，每个化合物的柱上进样量为5皮克时，19个化合物的正离子模式多反应监测离子流图的叠加图。

 

　　图5为在负离子模式下，柱上进样量为10皮克时的10个药物化合物的多反应监测离子流图的叠加图。在图4和5中，分析时间相对变短，信噪比提高。

　　表3列出了19个化合物（ESI正离子模式）在浓度范围是1、5、10、20、40、100、200、400和1000 pg的线性曲线。采用两种校正模式，线性和二次方程模式，两种模式都采用过原点及无权重计算。某些化合物的拟和度从线性模式到二次方程模式有了明显的改进。这是化合物的特性所决定的。

　　表4显示了每个分析化合物的柱上进样量约为5皮克时，六次进样分析的精密度数据。除了氟西汀（精密度的平均偏差是23%），所有的化合物的分析结果精密度都小于15%。

　　表5列出了在电喷雾负离子模式下，11个药物的线性度（样品浓度范围是，10、20、40、80、400和800pg的柱上进样量）。除了三氯二苯脲之外（R2是0.97），所有的R2值都大于0.99。

　　当分析方法建立完成之后，就可以进行环境样品中目标化合物的筛选和定量分析。图6、7、8是水样在正离子和负离子模式下，多反应监测分析结果。

 

 

　　图6的分析结果表明，水样中检出如苯海拉明和对乙酰氨基酚。这两个化合物对于几个水样都很常见。另外，还检出一些抗生素化合物。更有趣的是，在图7和8所示的结果中，还检出与高血压和胆固醇的治疗药物。

结论

　　使用固相萃取和液相色谱/质谱/质谱技术，分析了正离子模式下19个化合物，负离子模式下11个化合物，灵敏度可到皮克水平，而且无需衍生化。在1皮克到1纳克的浓度范围内，具有很好的线性度。在5皮克浓度下（柱上样品量），六次进样的精密度（%RSD）都在15% 之内，只有氟西汀在23%。

　　本方法可以用于水样品中常见药物的筛选和定量分析。

参考文献

1. USGS SOP: Instrumental Analysis for Determination of Human Health Pharmaceuticals in Water by Chemically Modified Styrene-Divinylbenzene Resin-Based Solid-Phase Extraction and High-Performance Liguid Chromatography/Mass Spectrometry, by Steve Werner, 2006.

　对于结构较简单的有机化合物，利用其氢谱、再结合其分子式（甚至仅知低分辨的分子量）便可推导出结构。

        分析氢谱如下：

　　(1) 区分出杂质峰、溶剂峰、旋转边带。
　　杂质含量较低，其峰面积较样品峰小很多，样品和杂质峰面积之间也无简单的整数比关系。据此可将杂质峰区别出来。
　　氘代试剂不可能100％氘代，其微量氢会有相应的峰，如CDCl₃中的微量CHCl₃在约7.27ppm处出峰。边带峰的区别请阅6.2.1。

　　(2) 计算不饱和度。
　　不饱和度即环加双键数。当不饱和度大于等于4时，应考虑到该化合物可能存在一个苯环（或吡啶环）。

　　(3) 确定谱图中各峰组所对应的氢原子数目，对氢原子进行分配。
　　根据积分曲线，找出各峰组之间氢原子数的简单整数比，再根据分子式中氢的数目，对各峰组的氢原子数进行分配。

　　(4) 对每个峰的δ、J都进行分析。
　　根据每个峰组氢原子数目及δ值，可对该基团进行推断，并估计其相邻基团。
　　对每个峰组的峰形应仔细地分析。分析时最关键之处为寻找峰组中的等间距。每一种间距相应于一个耦合关系。一般情况下，某一峰组内的间距会在另一峰组中反映出来。
　　通过此途径可找出邻碳氢原子的数目。
　　当从裂分间距计算J值时，应注意谱图是多少兆周的仪器作出的，有了仪器的工作频率才能从化学位移之差Δδ(ppm)算出Δν(Hz)。当谱图显示烷基链³J耦合裂分时，其间距（相应6－7Hz）也可以作为计算其它裂分间距所对应的赫兹数的基准。

　　(5) 根据对各峰组化学位移和耦合常数的分析，推出若干结构单元，最后组合为几种可能的结构式。每一可能的结构式不能和谱图有大的矛盾。

　　(6) 对推出的结构进行指认。
　　每个官能团均应在谱图上找到相应的峰组，峰组的δ值及耦合裂分（峰形和J值大小）都应该和结构式相符。如存在较大矛盾，则说明所设结构式是不合理的，应予以去除。通过指认校核所有可能的结构式，进而找出最合理的结构式。必须强调：指认是推结构的一个必不可少的环节。

　　

1.元素周期表中所有元素都可以测出核磁共振谱吗？

        不是。首先，被测的原子核的自旋量子数要不为零；其次，自旋量子数最好为1/2（自旋量子数大于1的原子核有电四极矩，峰很复杂）；第三，被测的元素（或其同位素）的自然丰度比较高（自然丰度低，灵敏度太低，测不出信号）。

2.关于样品管，要注意什么？

        对于 5mm 探头来说，其中探头内部隔离样品和线圈的石英管内径只有5.4mm，如果样品管过粗或者弯曲，很容易卡在探头里甚至挤碎石英管；如果样品管过细或者有裂纹，很容易造成样品管在探头内破碎，污染探头。因此在使用样品管前，首先要在平面上滚动，确定平直；然后对灯光仔细检查有无裂纹；插入转子时要注意是否过紧过松。探头故障是我们遇到最多的问题，损坏探头可能造成数百到数万欧元的维修费用，建议谱仪管理员确保所有的送样人员了解这些细节，并检查样品管质量。

3.溶剂的用量多少为合适？

        在我们的定深量筒上都绘有相应线圈的位置及长度，一般只要保证样品的长度比线圈上下各多出3mm 即可，过少会影响自动匀场效果，过多浪费溶剂而且由于稀释了样品，减少了处在线圈中的有效样品量。这种情况下要注意将样品液柱的中心与定深量筒上的线圈中心对齐。

4.高场的核磁共振仪和低场的核磁共振仪测出的谱有什么区别？

        首先，高场的核磁共振仪比低场的核磁共振仪灵敏度高，如果样品浓度低，低场的核磁共振仪测出的谱图信噪比低，改用高场的核磁共振仪信噪比会改善。其次，高场的核磁共振仪比低场的核磁共振仪测出的峰分得更开，谱图的解析更容易些。但是，需要准确的偶合常数时，用低场的谱仪测更好些。

5.核磁共振仪有几种探头？

        从所测原子核的种类分，有：碳氢探头、碳氢磷氟四核探头、多核探头。还可以分为正向探头（测碳谱的灵敏度高）、反向探头（测氢谱的灵敏度高）、普通探头（每测四次完成一个循环得一个结果）和梯度场探头（不需要相循环，测一次得一个结果）。

6.如果样品吹不出来，应该怎么处理？

        首先查看各个气压表示数，检查压缩空气是否正常。如果压缩气没问题，很可能是样品卡在探头里了。可以将探头的固定螺丝拧开，下沉约5厘米，然后装回，（或者说把探头拆下再装回去）再吹一次。一般可以吹出。

7.lockdisp窗口中锁线的意义是什么？

        时间轴折叠的氘信号强度谱

1.测试核磁共振需要多少样品量？

        不同场强需要的样品量不同，如300兆核磁、分子量是几百的样品，测氢谱大约需要2mg以上的样品，测碳谱大约需要10mg以上。600兆核磁测氢谱大约需要几百微克。

2.配制样品为什么要用氘代试剂？怎样选择氘代试剂？

        因为测试时溶剂中的氢也会出峰，溶剂的量远远大于样品的量，溶剂峰会掩盖样品峰，所以用氘取代溶剂中的氢，氘的共振峰频率和氢差别很大，氢谱中不会出现氘的峰，减少了溶剂的干扰。在谱图中出现的溶剂峰是氘的取代不完全的残留氢的峰。另外，在测试时需要用氘峰进行锁场。
        由于氘代溶剂的品种不是很多，要根据样品的极性选择极性相似的溶剂，氘代溶剂的极性从小到大是这样排列的：苯、氯仿、乙腈、丙酮、二甲亚砜、吡啶、甲醇、水。还要注意溶剂峰的化学位移，最好不要遮挡样品峰。

3.测试样品是否必须家TMS？

        测试样品加TMS（四甲基硅烷）是作为定化学位移的标尺，也可以不加TMS而用溶剂峰作标尺。

4.怎样做重水交换？

        为了确定活泼氢，要做重水交换。方法是：测完样品的氢谱后，向样品管中滴几滴重水，振摇一下，再测氢谱，谱中的活泼氢就消失了。酰胺类的氨基氢交换得很慢，需要长时间放置再测谱。

5.用哪些氘代溶剂测出的氢谱上看不到活泼氢的峰？

        甲醇、水、三氟醋酸都有重水交换作用，看不到活泼氢的峰。

6.可以使用混合氘代试剂吗？

        可以。但是化合物在混合溶剂中由于溶剂效应，峰的化学位移和一种氘代溶剂的不同。

7.为什么氘代丙酮、氘代DMSO（二甲亚砜）的溶剂峰为五重峰？

        溶剂峰的裂分是由于氘对氢的耦合，根据2n+1规律，两个氘对一个氢耦合裂分成五重峰。

1.位移试剂有什么用途？

        当样品峰相互重叠时，可以用位移试剂把这些峰拉开，便于谱解析。

2.不锁场可以测样品吗？

        为了使磁场稳定，测试样品时要进行锁场；如果不锁场也可以测试样品，但因为磁场稳定性差，测出的谱图分辨率较低。

3.设置参数时，观察偏置表示什么意思？

        在测图谱时，我们不能同时观察0到几百兆赫的范围，所以我们先设置一个谱宽，以这个谱宽为窗口去观察共振的某一范围。设置观察偏置就是定了观察位置。所以改变观察偏置，谱中各峰的位置就会改变，实质也是观察范围改变了。

4.为什么同一碳上的两个质子会有不同的化学位移？

        因为同碳上的这两个质子表现出了磁不等价。如有些难翻转的环上的碳位置固定，不能旋转，它上面的两个质子处于环的不同位置，受到的磁屏蔽不同，所以化学位移不同。还有的碳虽然不在环上，但是连接了两个大的集团，旋转受阻，两个质子收到的磁屏蔽不同，化学位移也不同。

5.化学位移可以给出哪些结构信息？

        氢谱中各种基团的化学位移变化很大，不容易记忆，但只要牢记住几个典型基团的化学位移就可以解决很多问题。如：甲基0.8 ～1.2ppm，连苯环的甲基2ppm附近，乙酰基上的甲基2ppm附近，甲氧基和氮甲基3 ～4ppm，双键5～7ppm，苯环7～8ppm，醛基8～10ppm，不接氧的亚甲基1～2ppm，接氧的亚甲基3～4ppm。

6.偶合常数可以给出哪些结构信息？

    可以从偶合常数看出基团间的关系，邻位偶合常数较大，远程偶合常数较小。还可以利用Kapulus公式计算邻位氢的二面角。对于有双键的化合物，顺式的氢之间偶合常数为6～10Hz，反式的氢之间偶合常数为12～16Hz。

7.NOE效应与去偶作用有什么不同？

    偶合是解决氢基团之间相邻的关系，它们之间的能量是通过键传递的。NOE效应是解决氢之间的空间相近，它们之间的能量是通过空间磁场传递的。

1.质子偏共振去偶可以用来确定碳的类型，为什么现在常用DEPT谱，而不同质子偏共振去偶谱？       
        质子偏共振去偶区分伯、仲、叔、季碳的方法是根据裂分成四重、三重、二重和单峰，如果峰离得近会产生重叠，不容易解析，而DEPT区分伯、仲、叔、季碳的方法是根据峰向上或向下，峰不会重叠，并且质子偏共振去偶的灵敏度比DEPT法的灵敏度低得多，所以现在常用DEPT谱区分碳的类型。
2.门控去偶和反门控去偶法有什么不同？        .
        门控去偶和反门控去偶之间的区别是工作时去偶门和接收门打开的时间不同。门控去偶谱可以从峰的裂分计算碳-氢偶合常数，反门控去偶是使分子各碳峰的强度相同以便定量。
3.DEPT谱有几种表示方法？       
        DEPT谱有两种表示方法：一种是DEPT135 °谱，伯碳向上，仲碳向下，叔碳向上，季碳消失，DEPT90°谱只有叔碳峰，DEPT45°谱季碳消失；另一种是把上面的谱编辑后，一个谱只有伯碳峰，另一个谱只有仲碳峰，还有只出叔碳峰或只出季碳峰。
4.都有哪些二维核磁共振谱？       
        有： 1H-1H相关COSY谱、1H-1H相关NOESY谱、13C-1H相关COSY谱、远程13C-1H相关谱、同核J分解谱、相敏COSY、与NOESY谱类似的ROESY谱（NOESY谱解决大分子效果好，ROESY谱解决中等分子效果较好）、TOCSY谱（自旋系统里所有的氢之间都出相关峰）以及HSQC谱（异核单量子相干）等。
5.什么是三维谱？       
        三维谱是一个立体图，它的相关峰是立体中间的点，用平面切开这个立体所得的平面图就是二维图。
6.解析合成化合物的谱、植物中提取化合物的谱和未知化合物的谱，思路有什么不同？      
         合成化合物的结果是已知的，只要用谱和结构对照就可以知道化合物和预定的结构是否一致。对于植物中提取化合物的谱，首先应看是哪一类化合物，然后用已知的文献数据对照，看是否为已知物，如果文献中没有这个数据则继续测DEPT谱和二维谱，推出结构。对于一个全未知的化合物，除测核磁共振外，还要结合质谱、红外、紫外和元素分析，一步步推测结构。
7.用X射线晶体衍射确定蛋白质的结构与核磁共振法有什么不同？    
        用X射线晶体衍射确定蛋白质的结构需要先把蛋白质制成晶体，在固体条件下测。核磁共振法要把蛋白质溶解在溶液中，在液体条件下测试。这两种条件测得的结果是不一样的。因为蛋白质在生物体中多以溶液状存在，所以核磁共振法测得的结果更接近实际状态。                      

做化学的朋友不可不收藏哦！

 

1. NMR Chemical Shifts of Trace Impurities: Common Laboratory Solvents, Organics, and Gases in Deuterated Solvents Relevant to the Organometallic Chemist

Gregory R. Fulmer*†, Alexander J. M. Miller‡, Nathaniel H. Sherden‡, Hugo E. Gottlieb§, Abraham Nudelman§, Brian M. Stoltz‡, John E. Bercaw‡ and Karen I. Goldberg†

^† Department of Chemistry, University of Washington, Box 351700, Seattle, Washington 98195-1700

^‡ Arnold and Mabel Beckman Laboratories of Chemical Synthesis and Caltech Center for Catalysis and Chemical Synthesis, Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, Pasadena, California 91125

^§ Department of Chemistry, Bar Ilan University, Ramat Gan 52900, Israel

Organometallics, 2010, 29 (9), pp 2176–2179

DOI: 10.1021/om100106e

Publication Date (Web): April 16, 2010

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/om100106e

 

2. NMR Chemical Shifts of Common Laboratory Solvents as Trace Impurities

Hugo E. Gottlieb,* Vadim Kotlyar, and Abraham Nudelman*

Department of Chemistry, Bar-Ilan University, Ramat-Gan 52900, Israel

J. Org. Chem., 1997, 62 (21), pp 7512–7515

DOI: 10.1021/jo971176v

Publication Date (Web): October 17, 1997

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jo971176v

 

 

 

或者到这里下载： http://www.box.net/shared/8uxioja85t

本站直接下载   核磁溶剂峰