采用GC/MSD DRS对残留农药进行全面筛查

前言

　　根据农药手册，目前世界上正在使用的农药有700多种[1]。大约600种农药是过去使用的，但现在已经禁用或不再销售。有一些农药早已不再使用，但它们仍然存在于环境中，还可能在植物和动物体内生物富集。在食品和饮料、在土壤、水和大气、在水生和陆生的动植物、在人类血液、脂肪组织和乳汁中，都能检测到痕量的农药或它们的代谢物。世界卫生组织根据农药对人的急性毒性将农药分成五类[2]。所分成的类别从“有急性毒性”到那些“正常使用时没有急性毒性”的种类。一些农药被归类为持久性有机污染物(POP)，致癌、致畸或内分泌干扰物。现在分析食品和环境样品中的农药，跟踪它们在环境中的分布以保证食品安全，是一项日常工作。

　　目前很多分析方法仅仅针对一部分可能存在的化合物。无论是食品还是环境样品，由于其中一些天然产物能够被一起提取出来，分析工作变得较为复杂。食品或组织提取物是非常复杂的样品基质，在分析之前需要进行若干样品净化步骤[3]。即便如此，在残余基质存在的情况下检测痕量的污染物也很困难。

　　为了提高效率，必须采用多残留方法(MRM)分析更多的农药。通常这些方法都采用带有元素选择性检测器的气相色谱仪(GC)来确定不同基质中的农药[4，5，6]。气质联用(GC/MS)已广泛地用于命中峰的确证。液相色谱(LC)常用于分析那些不能采用GC分析的化合物[2]。现在，越来越多的农药实验室利用液质联用(LC/MS)和气质联用(GC/MS)作为基本的分析工具[7，8]。许多多残留方法(MRM)仍然是针对部分目标农药而建立的方法。但采用这种多残留方法，任何不在目标化合物列表中的农药都可能会被漏掉。

　　本文采用保留时间锁定(RTL)[9，10，11]和谱图Deconvolution技术[12]，建立了一种能够筛查567种农药和可疑内分泌干扰物的简单的GC/MS分析方法。谱图Deconvolution能够帮助识别农药化合物，即使农药被共流出的基质化合物所包埋，同样也可以被识别。保留时间锁定能够消除假阳性，使结果更可靠。需要时，使用者很容易在该方法中加入新的化合物。

实验部分

　　表1列出了安捷伦公司在农药分析中采用的仪器、软件和分析参数。根据进样量的需要，可以采用PTV进样或分流/不分流进样。

样品

　　蔬菜提取物由美国加州食品农业局(CDFA；Sacramento，CA USA)的Mark Lee和Stephen Siegel博士和新西兰TNO营养和食品研究所( Zeist ， The Netherlands)的J.G.J.Mol博士提供。17个地表水的GC/MS分析数据文件也由CDFA提供，并在本实验室采用DRS进行了处理。17个作物提取物的GC/MS数据文件(锁定在安捷伦农药分析方法中)由英国NRM实验室(Berkshire，UK)提供。

结果与讨论

保留时间锁定(RTL)和RTL数据库

　　保留时间锁定(RTL)是由安捷伦公司开发的一种技术，采用这种技术使用者可以在世界上任何一个实验室的任何一台Agilent 6890 GC上使分析物的保留时间相匹配，前提是采用相同的常规GC方法和毛细管柱[13]。采用RTL技术，安捷伦公司开发了几个用于GC和GC/MS的保留时间锁定数据库，包括每一次进样的锁定保留时间、化合物名称、CAS号、分子式、分子量和质谱图(只在GC/MS数据库中提供)[14]。安捷伦RTL农药库包含了几乎所有可用于GC分析的农药和一些内分泌干扰物的信息，共567个化合物。要采用以下讨论的DRS，这个信息库需要转换成NIST格式[15]。AMDIS所使用的包含有保留时间和化合物信息的谱库是由原来的RTL农药库生成得来的。使用者可以很容易在这些库中加入新的农药或其它感兴趣的化合物[15]。

Deconvolution的基本知识

　　在GC/MS中，Deconvolution是一种数学技术，它可以将重叠的质谱图“分开”成为“清晰”的单个组分的谱图。图1是这个过程的简单示意图。这里分别是总离子流色谱图(TIC)和质谱图。与常见的情况一样，这个色谱峰包含了多个重叠在一起的组分，而最高点质谱图实际上也是这些组分的组合图。质谱谱库检索只可能给出一个较差的匹配，而且不能识别所有构成这种组合谱图的单个化合物组分。

Deconvolution过程是在寻找那些单个丰度在谱图中上下一起波动的离子。它首先校正了四极杆质谱固有的谱图偏斜，为每一个色谱峰得到了一个更准确的顶点保留时间。如图1所示，Deconvolution为每个重叠的组分提供了“清晰”的谱图。在用谱库检索时这些单个谱图就可能得到良好匹配。

　　这种包括在安捷伦DRS软件中的AMDIS软件由国家科学技术研究所(NIST)提供[12]。

DRS

　　安捷伦公司的DRS是由三个不同的GC/MS软件包组合而成的：1)安捷伦GC/MS化学工作站，2)带有NIST‘02质谱谱库的NIST质谱检索程序，3)AMDIS软件，也来自NIST。在DRS软件中包含有567种农药和可疑内分泌干扰物的质谱图和锁定保留时间信息库。

　　DRS包括三个独立但互补的数据分析步骤。首先，GC/MS化学工作站软件采用一个目标离子和3个以上的定性离子对目标农药进行常规的定量分析，并报告所检测的校正化合物的含量。对于数据库中的其它化合物，可以采用DRS软件提供的平均农药响应系数(RF)估算它们的含量值并报告结果。然后，DRS将数据文件发送到AMDIS软件，进行谱图的Deconvolute并采用Deconvoluted全谱图在安捷伦锁定保留时间RTL农药库中进行检索(以AMDIS格式)。在AMDIS中可设置一个过滤器，要求分析物的保留时间必须落在由使用者规定的时间窗口。由于RTL是用来给出高精度的RTL数据库保留时间的，这个窗口可以设得很小，通常为20秒或更短。最后，由AMDIS找到的所有目标化合物的Deconvoluted谱图在147,000个化合物的MIST质谱谱库中进行检索确证。在这一步骤中，不需要保留时间。

　　一旦建立合适的方法，只需要简单的点击鼠标，DRS报告就可以生成，如图2所示。这个软件可以在每次分析完成时或在分析之后对一个单独的文件或一批文件自动运行。

中草药混合物中的农药

　　图3是一个中草药混合物的提取液的总离子流色谱图。图4是该样品的MSD Deconvolution报告，该报告是以HTML格式形成的，以便于通过电子邮件发送或拷贝到电子表格中。选择这个样品是因为草药属于最难分析的植物样品。它们的提取液中含有大量的天然产物会影响农药的分析。

　　图4中的DRS报告列出了每个命中峰的保留时间、CAS序号和化合物名称。报告下端列出的菲-d10是内标物(ISTD)，化学工作站利用它来估算所检出的每个化合物的含量。由于所有的567种目标化合物都采用了一个平均农药响应因子，因此第4列列出的含量值仅仅是估算值。实验表明，报告中大多数采用平均农药响应因子得到的含量估算值都落在它们真实值的10倍范围内。准确的定量要求采用常规的农药标准品进行校正，但对于数据库中所有的农药进行逐一校正是很难实现的。在实验室通常可以对一部分目标农药制备校正曲线，对数据库中的其它化合物则采用它们的平均响应因子来进行计算。采用这种方法，当一种新的化合物被检出，实验室很快可以得到其含量的估算值并决定是否需要将它加入校正列表。

　　报告的第5列列出了利用AMDIS进行去卷积并采用Deconvoluted全谱图在保留时间锁定(RTL)农药库中进行检索得到的匹配系数。在本例中，AMDIS比化学工作站软件识别出了更多的目标化合物(如扑灭通和p,p-DDE)，这是一个典型的复杂样品。当得到锁定的保留时间后，在AMDIS软件中可设置一个保留时间范围是一个重要的优点。此时，那些落在数据库保留时间RT±10s范围之外的峰被去掉。第6列列出了化合物的信息库RT值和它们在色谱图上的真实保留时间值之间的差别(单位是秒)。

　　图4说明除农药以外，该软件还识别了两个邻苯二甲酸酯类(可疑的内分泌干扰物)。邻苯二甲酸酯类在环境中普遍存在，极难从背景中除去。在这种情况下，没有采取措施去确定这些邻苯二甲酸酯类是从样品中提取出来的还是在实验中引入的。

　　DRS报告中的最后两列列出了所有的AMDIS峰在NIST 147,000个化合物质谱谱库中进行检索的结果。当NIST谱库检索发现一个化合物属于匹配的前100个(可由使用者设定)，与AMDIS的结果一致，它的匹配系数就被列在第7列。命中峰的序号列在最后一列，在NIST中“1”表示是最好的匹配(匹配系数最高值)。有时NIST谱库检索找不到谱图匹配前100名的AMDIS命中峰。这时，报告中的下一行列出了该谱图的最佳谱库匹配。氟胺氰菊酯(图4)就是一个例子，该化合物在34.779 min流出。下一行列出了氟胺氰菊酯，它是那个谱图的最佳NIST谱库匹配。此时，在NIST质谱谱库中没有化合物与氟胺氰菊酯有相同的CAS序号。事实上，氟胺氰菊酯-tau-I是一个D型异构体，而氟胺氰菊酯是DL异构体混合物。

DRS和传统数据处理进行盲样的比较

　　比较表明，从复杂样品例如食品和环境基质中识别目标化合物方面DRS比传统方法优越得多。下面是两个相关的研究。第一例情况，英国Berkshire的NRM实验室采用安捷伦保留时间锁定农药方法分析了17个未添加农药的作物样品。将得到的数据文件(不是他们所列出的农药命中峰)发送到安捷伦采用新的DRS进行分析。表2比较了两个实验室的分析结果。采用手动数据处理，NRM从17个样品中检出了28种农药，其中4种低于它们的最低校正水平。采用同样的数据文件，DRS检出了33种农药。

安捷伦的自动方法没有识别春季洋葱样品中的嘧菌酯，因为它不包括在RTL农药库中。但是它能够被NIST谱库找到，它在403 amu处有分子离子，而NRM采用的方法只扫描到400 amu。DRS方法确证了所有四种低于NRM校正范围的农药，并找到了在它们的方法中没有包括的另外五种化合物(特草定、嘧霉胺、甲硫威、哒螨灵和霜霉威)。

　　手动和自动方法的一致性很好。但是，DRS能找到更多的农药，它能够找到那些被手动方法漏掉的化合物。此外，采用手动数据处理分析17个样品需要花费一个化学家大约7小，而DRS只需要计算机花50分钟即可完成。

　　地表水样品的分析：在另一个研究中，CDFA分析了17个地表水提取物中的农药。图5是两个典型样品的TIC总离子流色谱图。CDFA采用保留时间锁定(RTL)和RTL数据库检索，但没有使用谱图Deconvolution。同样的数据文件采用DRS进行对比分析。

表3列出了对17个CDFA样品的手动分析和DRS分析的对比结果。CDFA在17个样品中检出38种农药命中峰，一些命中峰是在不同样品中的相同农药。一个熟练分析人员花费了大约8小时进行结果分析，包括去掉假阳性并确证所有的命中峰。DRS找到了CDFA检出的37种化合物并识别了CDFA的一个假阳性的命中峰。此外，还检出了另外34种农药，17个样品中一共识别了71个命中峰。这个过程完全自动化，仅仅是计算机花费了大约20分钟时间处理所有的数据文件。

结论

　　安捷伦公司新的农药分析DRS给实验室带来了一些真正的便利。
　　• 容易使用：该软件使用十分简单，不会比使用6890N/5973 inert GC/MS系统需要更多的技术。使用者不需要学习有关复杂的Deconvolution知识或掌握一个新的软件包。
　　• 自动化：Deconvolution报告能够在每运行一次后自动生成，也可以将一批样品一起处理。
　　• 节约时间：数据处理的时间从几小时缩短为几分钟。
　　• 质量：它给出的报告假阳性和假阴性最少。
　　• 重现性：分析结果不取决于操作者的技术或经验。
　　• 准确度：本文讨论中进行的比较说明DRS在识别农药方面比手动数据分析具有更高的准确度。它对于相对复杂一些的样品尤其适用，因为这些样品的共提物基质组分可能会掩盖痕量的目标农药。
　　• 全面：该方法采用一次简单的GC/MS运行即可筛查几乎所有可采用GC分析的农药和一些可疑的内分泌干扰物。该方法共包括567种化合物，是现有的最全面的农药筛查工具。在需要时使用者还可以在方法中加入更多的化合物。
　　• 提供定量、半定量和定性结果：所有校正化合物都可以定量检测。其它任何一种化合物的含量都可以采用由软件提供的平均农药响应因子进行估算。

　　DRS的使用并不仅仅局限于农药分析中。其它目标化合物质谱谱库也可以转成AMDIS格式来使用这个软件。例如，可以利用已有的毒物、香精香料、有机污染物等的谱库。使用者甚至可以利用DRS建立自己的谱库。虽然并不是必需要求，但对每一次进样都建立一个包含有锁定保留时间的RTL信息库是很有好处的，因为这样将给出最少的假阳性结果。

致谢

　　作者非常感谢加州食品和农业局的Mark Lee和Stephen Siegel博士、Netherlands TNO研究所的J.G.J.Mol博士和英国NRM实验室的管理和工作人员，感谢他们提供了样品和数据。