采用Agilent 1200系列液相色谱系统进行药物杂质分析

概述

引言

　　在日常质量控制和质量保证工作中，药物中的杂质分析从初步筛选开始，以使用认证方法结束。在药物价值传递链上，药物杂质分析日益成为了一项具有挑战性的任务。本汇编就高分离度快速液相色谱(RRLC)与质谱联用如何用于药物中杂质分析和定性提供一个指南，以提高您的工作效率。综述了安捷伦最近的一些有关药物中杂质分析的应用文摘。这些文摘以详细摘要的形式介绍，若需深入阅读全文，您可以从下面的网站下载：
www.agilent.com/chem/library。

药物中的杂质

　　通常，从两个方面关注药物中的杂质：
　　• 化学方面包括对杂质的种类和鉴定，涉及到如何生成报告、如何设定适当的指标，以及描述分析步骤。
　　• 更重要的是病人的安全方面，当新药上市时，这些病人将要使用最终产品。在这方面，比较研究和基因毒性测试变得越来越重要。

　　从法规机构如美国食品和药品管理局(FDA)和EMEA等的观点看，药物中的杂质分成以下几类：
　　• 有机杂质（与工艺和药物相关）
　　• 无机杂质
　　• 残留溶剂

　　本汇编提供的应用文摘系列“使用Agilent 1200系列液相色谱系统分析杂质”主要讨论有机杂质：
　　• 第一部分：采用LC/MS鉴定杂质的结构(5989-5617EN)
　　• 第二部分：采用制备HPLC分离杂质(5989-5618EN)
　　• 第三部分：为方法开发快速确定分析条件(5989-5619EN)
　　• 第四部分：超快速方法的方法认证(5989-5620EN)
　　• 第五部分：附有完整步骤的QA/QC应用举例(5989-5621EN)

　　在第15页的附录中有详细的无机杂质和残留溶剂文献.

示例研究

　　本汇编中有5个应用文摘说明了在药物开发和商品化过程中典型分析方法开发和QA/QC实验室的分析流程，即，在药物活性成分中分析测定与生产有关的杂质。

　　在研究的初期，采用高分离度快速液相色谱，通过加快分析速度，并与飞行时间质谱联用，提供准确的质量信息，这就大大改进了分析过程。有机杂质来源有多种、浓度各不相同，它们最可能来源于药物活性物质的合成和储存过程，也可能来自最终药物产品的制造工艺和/或储存过程，可能来自于：
　　• 起始原材料
　　• 副产物
　　• 中间体
　　• 降解产物
　　• 试剂和配体，
　　也有来自包装材料的。

　　根据FDA的指南“药物中的杂质”，含量低于0.1%的杂质一般不必进行鉴定。然而，对于那些可能有异常作用、0.1 %以下浓度也可产生毒性或药理作用的潜在杂质就应当进行鉴定。在所有情况下，杂质都应该定性。

　　虽然现实中一般把0.05 %到0.09 %的分析结果取近似值（即0.1 %），但本指南的目的，在确定是否对杂质进行鉴定时，这样的值不应当近似为0.1 %。总之：为了减少潜在的副作用，需要对杂质进行灵敏的测定，而飞行时间(TOF)质谱能够提供高灵敏度测定和准确质量鉴定，是鉴定痕量杂质的首选方法。

副产物分析

　　本出版物介绍的分析步骤主要涉及原料、副产物和中间体的分析，以及如何在鉴定过程中及早有效地检测它们。关于包装材料和有机挥发性杂质(OVI)分析的详细说明可参看附录。杂质分析遵循典型的方法开发流程，方法优化／转移以及最后在GMP条件（图1）下常规使用。

　　安捷伦科技长期以来致力于为制药行业的分析化学家提供合适的仪器，以持续提高分析速度，并实现更高灵敏度的药物分析。我们希望这个汇编是有用的，能够提供保证病人安全的方法。

1. 采用LC/MS鉴定杂质的结构

引言

　　在现代制药业、药物开发和制造中，准确地鉴定微量杂质和副产物是极端重要的，因为杂质和副产物可能对人体有潜在的毒性。在药物研发的各个阶段分析杂质是非常重要的，而且是整个工艺的瓶颈。例如，本应用文摘讨论了用高分离度快速液相色谱离子阱和电喷雾oaTOF质谱鉴定药物合成过程中的副产物。

实验

仪器

　　Agilent 1200系列高分离度快速液相系统(RRLC)，
　　Agilent 6210飞行时间质谱
　　Agilent 6330离子阱质谱

方法


结果与讨论

　　合成的主要产物是药物和其非对映异构体，微量杂质A（图1）。其它的可能杂质是降解产品（杂质B, C和D）以及合成的离析物（杂质E和F）。要在一个药物化合物中发现所有可能的杂质，很重要的一点是使用几种正交的分离技术，比如液相色谱、气相色谱或薄层色谱。仅用LC/UV分析，合成中使用的离析物与它们的保留时间对比证明杂质F是3-bromanisole（图1）。离析物杂质E用UV和ESI-MS都没有检测到。所以，又用GC-FLD分析了样品，可以检测到该化合物，并通过保留时间比较得到了证实（数据略）。为证实所有杂质的分子结构，进行了LC/MS-TOF分析，以测定准确的分子量并计算经验分子式。该实验可在低ppm下，以足够准确的质量确证所有建议的分子式。要获得有关杂质更详细的结构信息，就要进行离子阱质谱分析（图2）。非对映异构体杂质(A)在保留时间8.20 min检测到，质量数为m/z 264.1。这一化合物的分子离子在MS/MS碎裂时由于失去水而产生碎片离子m/z246.1；在三级质谱(MS³)解离时，离子m/z 246.1由于失去甲氧基而产生主要离子m/z 215.1；失去甲基氨基产生离子m/z 202.1，以及与苄基阳离子相关的碎片离子m/z 121.1。

结论

　　我们论述了使用Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱系统，1.8-μm的RRHT色谱柱，并与Agilent 6330离子阱和Agilent 6210 ESI TOF质谱联用来对药物的微量杂质进行检测和结构鉴定。采用1200系列RRLC系统，在1.8-μm色谱柱上实现了检测所有杂质需要的分离度。离子阱串联MS/MS和MSⁿ，可用于结构鉴定，ESI-TOF通过准确测定质量可用于初步分子式的确证。

2. 使用制备HPLC分离杂质

引言

　　杂质分析是一系列分析活动，目的是对药物中的有机和无机杂质进行检测、鉴定、结构解析和定量测定¹。这一过程的第一个任务是检测所有杂质，为此要使用各种正交分析技术，如气相色谱，毛细管电泳和高压液相色谱，包括联用的MS技术，如离子阱和飞行时间(TOF)质谱。然而，即使采用最先进的质谱系统，解析所有化合物的结构也常常是不可能的。这些化合物必须分离和纯化，然后用¹H-和¹³C-NMR进行表征。这里介绍了一对用MS不能鉴定的化合物的分离和纯化。

结果与讨论

　　如Agilent应用文摘²中所述，采用离子阱和飞行时间质谱可以鉴定两种杂质（A和D）。然而，另外两种杂质（B和C）却不能完全鉴定，所以采用制备HPLC进行分离以便实现进一步结构鉴定。分析方法²是针对杂质B和C的分离度以及较短的分离时间而优化的。方法放大之前，采用分析柱进行了上样实验。1.0444 mg原样注射到ZORBAX SB-C18色谱柱上（4.6 x 150 mm, 5 μm）仍然可以实现杂质B和C的基线分离。

放大计算

　　在富集的样品中，杂质B和C的浓度约为主要化合物的3 - 5 %，也就是说，在分析柱上每次进样只可分离每种杂质约0.03 - 0.05 mg。因此，将分离放大到21.2 mm内径的制备柱上，粗样上样量约22 mg，每次进样可分离每种杂质约0.66 - 1.1 mg。这样，不用十次进样就能得到足以进行NMR分析的样品量。

纯化参数

　　使用化学工作站的Fraction Preview功能优化馏分收集参数。调用一个制备运行的色谱图，调节馏分收集参数，如阈值(threshold)、上行斜率(up slope)、下行斜率(down slope)和上限阈值(upper threshold)等³，直到实现预期收集效果。在此情况下，时间窗口（9 - 14秒）内只基于阈值的收集就给出了最佳结果。图1显示了使用Fraction Preview优化参数得到的实际馏分收集运行结果。

　　将十次连续纯化运行收集的杂质合并，杂质C（纯度98.7 %）和杂质B（纯度98.2 %）的量就足以用NMR进行结构分析（图2）。

结论

　　从Agilent 1200系列RRLC系统上开发的高分离度分析方法开始，说明了两种杂质的分离和纯化。方法转移到从Agilent 1200系列LC系统和从Agilent 1200系列制备系统是非常方便的，因为从Agilent的固定相既有用于分析柱的亚2微米的填料，也有用于制备柱的标准5-μm填料。所以，方法优化和上样实验之后的制备放大可以直接完成，而不必在制备柱上进一步优化方法。化学工作站的功能，如Fraction Preview和馏分自动收集很容易在短的时间内实现最佳纯化。收集馏分的高纯度和回收率使得杂质结构鉴定成了一件很容易的工作。

3. 快速筛选方法开发的条件

引言

　　“开发和认证新的分析方法成本高且费时”¹所以，任何可减少单次分析运行时间的措施对整个分析过程都是有利的，但绝不能损失分离度、灵敏度、特别是可靠性。Agilent提供亚2微米填料粒径度的色谱柱，以及1000倍以上使用寿命的高质量，这使得方法开发过程大为加快。开始时，常常要确定较宽的分离条件范围，如固定相、流动相参数（% B, 缓冲液，pH，溶剂）和操作参数如梯度陡度、温度等等，以确定最佳初始条件，然后进行微调。本应用文摘讨论了使用Agilent 1200高分离度快速液相色谱(RRLC)系统和各种Agilent ZORBAX RRHT色谱柱来确定每次分析不超过4 min的分离条件，以及分离位置异构体化合物和非对映异构体的分离效率。

实验

　　所有实验均在Agilent 1200系列RRLC系统上完成，配置有SL型二元泵，温控高效SL型自动进样器，SL型柱恒温箱和SL型二极管阵列检测器。在条件筛选过程中，测试了16种不同的条件。下列Agilent ZORBAX色谱柱用作固定相：StableBond CN,StableBond C18, Extend C18, EclipseXDB C8和Eclipse XDB C18。流动相是HPLC级水和甲醇或乙腈，以及不同的添加剂。酸度条件为：0.2 %TFA（强溶剂为0.16 %)，pH 1.92，弱酸条件是磷酸缓冲液，pH=6.02，最终的碱性条件是：0.2 %氨(pH=11.0)。色谱柱、流动相和pH的所有可能组合中，只试验了合理的组合。初始筛选采用3.0 mm ID x 50 mm的色谱柱、低延迟体积的泵配置和5（L/6mm流通池的DAD。选择一支4.6-mm ID的色谱柱进行方法微调，使用标准延迟体积的泵配置和13（L/10 mm的检测器流通池。所有筛选试验采用梯度为5 - 95 % B，温度40℃。更详细的情况请参阅第10页的参考文献2。

结果与讨论

　　本方法开发的目的是提供一个快速而耐用的方法，用于药物生产过程中杂质的定量，药物为碱性盐，pKa 9.4，易溶于水。从前面的实验我们知道，采用其它技术如GC或TLC，而不是HPLC，就可以很容易地检测到反应试剂。故将关注点放在非对映异构体A和区域去羟基化产物B和C、以及去甲基化产物D的分离上（见图2的分子结构）。

　　在初期条件筛选过程中，使用富集了杂质的样品，对于不同的固定相和流动相组合采用了5-95 % B的宽范围梯度。正如所料，改变流动相和／或固定相，选择性就发生变化，对色谱分离结果有显著的影响。选择了错误的条件可能导致错误的结论：样品是很简单的混合物。其它条件显示有4个峰，最后的条件5个化合物都检测到了。图1给出了显示选择性变化作用的实例。在选择微调的最佳初始条件进行微调时，只考虑分离度小于2的难分离物质对不超过1对的条件。最后，选择了StableBond C18色谱柱进行进一步优化。微调首先将条件转移到一支4.6mm ID的色谱柱上，这样的柱内径是制造业QA/QC环境优选的。然后，将梯度范围变窄，还研究了温度对微调方法的影响。最终方法对所有混合物可以得到大于3的分离度（图2）。表1列出了分离含有低浓度（主成分的0.05 %）杂质的样品的某些特征值。如参考文献3和4所述，开发的方法能满足标准认证程序以及在制药QA/QC条件下应用的所有要求。

结论

　　使用Agilent 1200系列RRLC系统和亚2微米粒径填料的色谱柱进行条件筛选和微调可以减少活性药物组分中难分离的非对映异构体和位置异构体杂质的方法开发时间。由于需要很短的筛选运行周期(4.5 min)，一天之内可以试验很多组条件（包括重复和空白运行）。其它的微调再用半天时间，所以，一天半之后就可提供一个方法用于后续的方法认证，由于采用最终方法每次单个运行的时间只有4 min，因此也会明显减少方法认证的时间。

4. 快速LC方法的方法认证

引言

　　为了保证分析结果符合法规要求，在满足法规依从性的分析实验室必须对他们的方法进行认证。此外，尽管他们使用不同的仪器。不同实验室的不同用户所得结果应是可比的，所以，方法必须尽可能稳定可靠，以对误差进行补偿，因为不同的用户在相同或不同的仪器上运行相同的分析时可能产生误差。这里介绍的认证程序是基于美国药典(USP)，ICH指南Q2B^1,2以及FDA指南的要求^4,5,这些要求为世界各国所认可，并被制药、食品、环境和化工分析实验室所采用。下面介绍分析一个主成分及其4个杂质的快速LC方法的认证，图1给出了典型色谱图。

认证程序

　　在预认证实验之后，设置了表1所列的认证协议。测试并给出了专属性³。没有采取进一步的样品制备步骤。称取样品化合物并溶于水。设定了组成的限量并与实测值比较以确定通过或失败（表2）。杂质的分析结果列于表3。

结论

　　为分析主成分和4种杂质开发了快速LC方法。该方法的认证是成功的，满足了涉及精度、线性、准确度和稳定可靠性的所有要求。这说明快速LC方法可以用于QA/QC实验室，且符合USP/ICH推荐的要求。快速LC方法提供了同样的数据质量，而且又有较高的样品通量。

5. QA/QC应用举例，采用快速LC方法实现高通量样品分析

引言

　　已经开发了一个快速分析LC方法，在对这一快速分析方法认证之后，下一步就是将这一方法转移到QA/QC实验室。通常，详细的标准操作规程(SOP)保证分析过程中出错和误解的几率尽可能小。下面是一个标准操作规程的例子，包括系统适用性测试、序列和结果通过认证的指标。Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱(RRLC)系统用来进行序列分析、系统适用性检测报告、样品和校准混合物的分析。色谱条件是基于以前的应用文摘所开发认证的LC方法，参见文献1和2。约5 min的样品分析周期应当大大提高了样品通量，进而降低了分析成本。下面是简化的SOP举例，并给出了结果举例。

性能测试

　　要确定一个样品是通过还是失败需要多次测试。必须使用校准混合物和对照样品，以及含有用来稀释样品的溶剂的空白样品。表1概要列出了测定样品分析的精度、灵敏度、分离度和其他性能参数的要求。基于该表定义的要求，在安捷伦化学工作站软件中设置了一个分析序列表（表2）。这个序列的开始是适用性测试样品，在3个样品和一个对照样品分析之前和之后是校准运行，在这些运行之间要注射纯水样品以保证没有记忆效应或鬼峰，因为这些会干扰下一次分析。

测试结果举例

　　作为一个例子，我们介绍系统适用性测试规程。要测试系统是否满足方法要求，制备了主成分和杂质A、B、C、D的溶液，浓度为4 - 10 μg/mL。每天第一次进样之前都要分析这个溶液。

　　测试的参数和极限值设置：
　　• 峰面积的精度必须< 2 % rsd
　　• 保留时间的精度必须< 0.5 % rsd
　　• 所有峰的分离度必须> 2
　　• 最大的半峰宽必须< 0.08 min
　　• k´必须5 < k′< 25
　　• 所有峰的信噪比必须> 50
　　系统适用性样品的测试结果列于表2。满足了所有的极限指标。以同样的方法，评价了校准标样和对照样品的参数指标。所有测试都满足了极限指标，被分析样品也通过了极限指标，3个样品的杂质含量均没有超过0.5 %的允许极限值。

结论

　　分析QA/QC部门面临着分析样品数量的逐渐增多以及对数据质量和可靠性越来越高的要求。一般来说，为保证定性和定量数据的正确性，一个样品需要运行10-15次。本文完整地认证的快速LC方法有助于显著提高样品分析通量，而不损失数据的质量。所用序列包含47次分析运行，包括30 min的系统适用性测试，共用3.9小时。若使用一个样品分析周期为20 min左右的方法，大致需要15.7小时。这说明快速LC方法明显提高了样品通量。

　　溶剂的节省也非常明显。采用20 min的样品分析周期，47次运行，流速为2.2 mL/min，需要溶剂2068 mL。而采用本文的快速LC方法，5 min的样品分析周期，47次运行只需要517 mL溶剂。
每次分析的成本因而也大大下降为大约原来的1/5~1/4。见表3的举例。

　　方法的重新认证可能需要2周时间，花费4000美元。在我们的例子中，在约500次分析运行之后，将方法升级为快速方法在成本上经济实惠。

附录

杂质分析

　　“Impurity profiling with the Agilent 1200 Series LC system ?Part 1: Structure Elucidation of Impurities with LC/MS”, Agilent Application Note, publication number 5989-5617EN, 2006.

　　“Impurity profiling with the Agilent 1200 Series LC System ?Part 2: Isolation of Impurities with Preparative HPLC”, Agilent Application Note, publication number 5989-5618EN, 2006.

　　“Impurity profiling with the Agilent 1200 Series LC system ?Part 3: Rapid Condition Scouting for Method Development”, Agilent Application Note, publication number 5989-5619EN, 2006.

　　“Impurity profiling with theAgilent 1200 Series LC System,Part 4: Method Validation of Ultrafast Method” Agilent Application Note, publication number 5989-5620EN, 2006.

　　“Impurity Profiling with the Agilent 1200 Series LC System Part 5: V.QA/QC Application Example with Complete Sequencing” Agilent Application Note, publication number 5989-5621EN, 2006.

行业指南

　　“Guidance for Industry NDAs: Impurities in Drug Substances,” U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER) CMC, February 2000.

　　“Guidance for Industry Q3B(R2) Impurities in New Drug Products,” U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) ICH Revision 2, July 2006.

残留溶剂

　　“The Determination of Residual Solvents in Pharmaceuticals Using the Agilent G1888 Network Headspace Sampler”, Agilent Application Note, publication number 5989-1263EN, 2004.

　　“The Determination of Residual Solvents in Pharmaceuticals Using the Agilent G1888 Headspace/6890N GC/5975 Inert MSD System”, Agilent Application Note, publication number 5989-3196EN, 2005.

　　“The Determination of Extractables and Leachables in Pharmaceutical Packaging Materials Using Headspace GC/MS”,Agilent Application Note, publication number 5989-5494EN,2006.

无机杂质

　　“Evaluation of conventional ICPMS and ORS-ICP-MS for Analysis of Traditional Chinese Medicines”,Agilent Application Note, publication number 5989-2570EN,2005.

　　“Determination of Toxic Elements in Traditional Chinese Medicine Using Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry”, Agilent Application Note, publication number, 2006.

　　“Routine Pharmaceutical Analysis:The Indispensable Solutions Guide to Proven Applications and Best Practices” CD, Agilent publication number 5989-5366EN, 2006.