用配置亚2 微米粒径色谱柱的液相色谱仪改进对生物样品中代谢物的分离

引言

　　在药代动力学(DMPK)研究中，体外和体内实验的目的都是鉴定与药物相关的组分[2,3]。当某些特殊代 谢物只用LC-MS 鉴定还不够，需要更多结构信息时，用LC 分离就成了关键步骤，要为核磁共振（NMR）分析等其它鉴定方法提供样品。代谢物要从各种复杂基质中分离，如血浆、尿液、粪便、肝脏和胆汁。在亚2 微米小粒径柱提供的快速和高分离度的推动下，对常规HPLC 方法重新评价，是否能作为一种缩短代谢物分离时间的方法[4, 5]。

实验

高分离度快速液相色谱

　　用一些实验来确定， 在高分离度快速液相色谱（RRLC）系统上用1.8 微米色谱柱是否改善了色谱分离。所用的RRLC 系统见图1。
　　• 1200 系列SL 型二元泵，配置微量真空脱气机
　　• 1200 系列高性能自动进样器
　　• 1200 系列柱温箱
　　• 1200 系列高速可变波长检测器
　　• 1100 系列分析级馏分收集器

　　色谱柱采用几种不同柱长和填料粒径的ZORBAX SBC18。为了保持恒定的样品加载量和流速，内径固定在4.6 mm。要获得合适体积的馏分，流速设置约为1 mL/分钟。所用色谱柱的详细情况如下：
　　• 4.6 x 250 mm, 5 μm, 部件号880975-906
　　• 快速分离4.6 x 150 mm, 3.5 μm，部件号863953-902
　　• 快速分离高通量4.6 x 150 mm, 1.8 μm，部件号829975-902
　　• 快速分离高通量4.6 x 100 mm, 1.8 μm，部件号828975-902

　　相关的方法参数包括：流动相A: 10 mM 醋酸铵，用醋酸调至pH 5.0，流动相B：75:25 乙腈: 甲醇。可变波长检测器(VWD)检测波长235 nm，峰宽设置> 0.005 分钟，或0.12-秒响应时间，配置标准流通池(部件号G1314-60086)。

　　原方法(4.6 x 250 mm 柱)的梯度表如下：

　　快速分离（RR）和快速分离高通量（RRHT）柱越短，时间将成比例地缩短。

样品

　　尿样的分析结果见图2 和图3。尿液样品的制备包括，取10 倍量的尿液在室温下真空离心干燥浓缩，然后用起始流动相复溶。进样前，样品再次离心，去除微粒。这种方法也可以用于血浆、肝脏匀浆和粪便匀浆。样品制备包括，用三倍体积的溶剂（1:3，样品：乙腈）旋涡混合分别提取三次，并离心。取出上清，混合，干燥。提取物用起始流动相复溶，离心，然后进样。在大多数情况下，胆汁可以不经过样品制备直接进样。

　　尿样分析的结果见图1 和图3。鉴定出的感兴趣药物代谢物为色谱图中的M5、M13、M15 和M17。

结果与讨论

　　在我们实验室里， 因为待测样品的复杂性， 用4.6 mm x 250 mm, 5 微米柱进行色谱分析的时间，可能在60 分钟到3 个小时。本研究的目标就是要用现有的方法，在保持分离度和测试量的同时，缩短分析时间。

　　每次进样加载物质的量部分地决定了所用的柱内径。通常，感兴趣的代谢物以每毫升纳克到微克水平存在于基质中，大量内源性物质占样品中的绝大部分。为了从内源性物质中获得最大量的代谢产物，经常要使色谱柱超载。大量内源性物质加载到色谱柱上，导致超载，影响色谱分离的完整性。要减少内源性物质与感兴趣代谢物的共洗脱，必须采取少量多次进样。对这种长达1 小时的分析，多次进样只分离非常少量的物质，显得相当浪费时间。虽然我们实验室不要求高通量，但提高通量还是很重要。这里显示的是用Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱快速分离柱得到的结果。代谢研究中经常要用14C 同位素标记化合物，将其作为一种有效方法，鉴定被内源性化合物背景掩盖下的药物相关物质。用亚2 微米色谱柱进行的这类研究将在以后的论文中发表。这里分析的是第一次从人体实验得到的样品，药物没有标记14C 同位素标记。为了分离制备，只监测和报告了UV 响应。

　　在图2 中，显示了对尿样分析的比较，样品中需要分离的代谢物水平非常低。原来在ZORBAX SB-C184.6 mm x 250 mm, 5 μm柱上建立的方法，分析时间为60 分钟。本样品在用于比较的4.6 mm x 100 mm,1.8 μm柱和4.6 mm x 150 mm, 1.8 μm及3.5 μm柱上分离。梯度曲线按柱长比例更改。

　　正如所期望的，随着粒径和柱长的减少，分离度和UV 响应都有了增加。对每根色谱柱每种代谢物UV响应和峰宽的比较见表1。每种代谢物的峰形都有明显改善，可以看到理论塔板数的增加。请注意，如果用更小的2.1 μm 内径柱，柱效还有可能进一步改善。

　　图2 还显示了方法的耐用性和用SB-C18 的可缩放性。不同的柱子配置，包括粒径和长度，对选择性的影响很小。从四种分离都具有相同的洗脱曲线就可以看出这一点。由于为了每次分析纯化出最大量的代谢物，有意识地让色谱柱超载，所以感兴趣的峰有拖尾现象。

　　用RRHT 4.6 x 100 mm 柱取代常规的4.6 x 250 mm,5 μm 柱时，同样的进样量，峰高平均增加了46%，峰宽变窄了44%。从而最大限度地减少了分离制备时峰的重叠，不再需要合并馏分。另外，分析时间也缩短了一半。这一优势使实验室效率有所提高。

　　将流速从1 mL/min 增加到1.5 mL/min，进样量从100 μL 减少到50 μL，将进一步提高柱效。图3 是将图2 中的RRHT 方法稍微进行了优化，重叠现象有所改善。分析速度快了3.8 倍，峰形也有所改善。1.5 mL/min 分析时的系统反压（最大）为464 bar，1 mL/min 分析时为315 bar，两者都在Agilent 1200RRLC 的操作范围内(600 bar)。ZORBAX 1.8-μm填料的粒径分布经过了专门设计，压力比其它亚2 微米填料更低。

结论

　　结果表明RRHT 技术提高了实验室的效率。用RRHT柱取代常规色谱柱，在不影响分离度的情况下，提高了通量。最大的收获是用更小粒径(1.8 或3.5 um)色谱柱，分离度的提高最大。用RRHT 柱取代了常规尺寸色谱柱后，峰高和峰宽都有了改善。另外，分析时间与柱长成比例地缩短。这些优点将带来实验室效率的提高。本方法在对复杂基质进行分析时（例如，尿和血浆）很容易在不同配置的SB-C18 柱（包括不同的粒径）之间放大和缩小，最大限度地简化了样品制备。