用高分离度快速液相色谱-UV和MS检测建立可靠的中药制剂质控方法

引言

　　中国长期使用中药和中药制剂，对其治疗作用有丰富的经验。但质量控制仅局限在外观检查是不够的。随着新技术的发展，已经发现某些中药中有几百种化合物，其浓度范围很宽。而且，产地不同和采摘时期不同，以及炮制和加工工艺不同，中草药的成分也不同。因此，对中药化合物的质量控制极具挑战性。现在，只测定中药制剂中一个或两个成分进行质量控制已经不够了，因为特殊配方的中药制剂都是由一种以上中药组成的。例如，芪参益
气滴丸，一种用于治疗冠心病的中成药，包含4种中药：
　　• 黄芪
　　• 丹参
　　• 三七
　　• 降香

　　本研究以芪参益气滴丸为样品，用高分离度快速液相色谱（RRLC）-紫外-可见检测器和质谱联用，建立中药质量控制的新方法。主要目标是建立一种可靠的方法，能够选测定在加热和混合过程中不变的潜在目标化合物。 

实验

仪器
　　• Agilent 1200系列RRLC系统包括：带真空脱气机的SL 型二元泵、SL型高性能自动进样器、配置微量流通池(2 μL体积，3 mm光程)的SL型柱温箱和二极管阵列检测器SL，
　　• Agilent 6410四极杆质谱仪，配置ESI离子源
　　• Agilent 化学工作站B.02.01 SR1，用于数据采集和分析
　　• Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色谱柱，3.0 x 50 mm, 1.8 μm粒径

标准品
　　丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参素、三七皂甙R1和黄芪甲苷均购自中国药品生物制品检定所(NICPBP)，人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、原儿茶醛、原儿茶酸、人参皂甙Re和人参皂甙Rc 购自Sigma-Aldrich 公司（美国）。

溶剂
　　乙腈购自Fisher 公司（美国），水由Milli-Q纯水系统制备。

样品和样品制备
　　芪参益气滴丸、黄芪、丹参、三七的中间提取物，及降香精油，由中国TASLY制药公司提供。原药材购自当地中药店。

　　滴丸、中药提取物和中药原料溶于70 %甲醇/水溶液中，超声提取30分钟，用0.22 μm滤膜过滤。

RRLC方法
　　• 流动相：
　　　A: 0.1 %甲酸水
　　　B: 乙腈，含0.1 %甲酸
　　• 梯度：0分钟，10 %B；8分钟，38 %B；12分钟，100 %B；持续3分钟，然后10 %B
　　• 流速： 1.0 mL/min（ 被动分流器将进入M S 的流速降至0.4 mL/min）
　　• 柱温：45 °C
　　• 检测波长：203 nm
　　• 峰宽：0.5 s
　　• 狭缝宽度：4 nm
　　• 光谱：190-400 nm，2 nm步进

标准品
　　丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参素、三七皂甙R1和黄芪甲苷均购自中国药品生物制品检定所(NICPBP)，人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、原儿茶醛、原儿茶酸、人参皂甙Re和人参皂甙Rc 购自Sigma-Aldrich 公司
（美国）。

溶剂
　　乙腈购自Fisher 公司（美国），水由Milli-Q纯水系统制备。

样品和样品制备
　　芪参益气滴丸、黄芪、丹参、三七的中间提取物，及降香精油，由中国TASLY制药公司提供。原药材购自当地中药店。

　　滴丸、中药提取物和中药原料溶于70 %甲醇/水溶液中，超声提取30分钟，用0.22 μm滤膜过滤。

RRLC方法
　　• 流动相：
　　　A: 0.1 %甲酸水
　　　B: 乙腈，含0.1 %甲酸
　　• 梯度：0分钟，10 %B；8分钟，38 %B；12分钟，100 %B；持续3分钟，然后10 %B
　　• 流速： 1.0 mL/min（ 被动分流器将进入M S 的流速降至0.4 mL/min）
　　• 柱温：45 °C
　　• 检测波长：203 nm
　　• 峰宽：0.5 s
　　• 狭缝宽度：4 nm
　　• 光谱：190-400 nm，2 nm步进

质谱方法
　　• 扫描：80-1400（正/负）
　　• 碰撞诱导解离电压：70（正/负）
　　• 干燥气体：12 L/min
　　• 雾化器压力：50 psi
　　• 干燥气温度：50 °C
　　• 毛细管电压：3200 V（正/负）

结果与讨论

　　用安捷伦方法转换计算器（光盘发行号5989-5130EN）将常规液相色谱方法转换成高分离度快速液相色谱方法。

丹参三七黄芪和降香提取物的比较
　　由图1可见，在203 nm检测波长下，丹参和三七的色谱图与混合提取物有很大区别。混合和加热后，某些峰消失了，同时出现了一些新的色谱峰。

　　目标化合物筛选是质量控制的重要步骤，可以确定加工过程中这些化合物是否发生了变化。大多数研究者都用203 nm进行检测，因为主要活性化合物是皂甙，在203 nm波长下有弱吸收。但203 nm处的大峰可能与质量控制无关，那些小峰可能对研究活性成分更重要。因此，需要另一种灵敏度更高的检测器，提供这些成分的更多信息。

不同检测器和条件之间的比较
　　图2 显示了紫外和MS检测的不同结果。在MS的总离子色谱图中有更多的峰，因为某些成分紫外吸收很弱或者没有吸收。用MS检测增加了另一维数据，并得到了这些不同化合物的结构信息。负离子模式给出了这些峰更完整的信息，可以对质量控制的目标化合物进行鉴定。

芪参益气滴丸和不同提取物之间的比较
　　图3 显示了丹参、黄芪和降香提取物与芪参益气滴丸（由这三种提取物和其它填加剂制成）的色谱图。标记数字的峰就是对这一中药制剂质量控制筛选到的目标化合物。根据UV和MS数据，研究不同的色谱峰，以确定这些化合物是否发生了改变。表1列出了鉴别的结果。

结论

　　本应用报告报导的RRLC-紫外和MS检测方法比目前药典控制单一组分的质量控制方法更可靠，因为能够根据UV和MS检测器提供的信息跟踪中药中几种成分的质量。跟踪这些成分非常重要，因为这些成分可能在炮制和加工过程中发生变化。质谱测定使用的Agilent 6140四极杆质谱仪，与Agilent 1200系列RRLC系统和Agilent化学工作站软件能够完全集成。