药厂洁净车间优势微生物种群分析

在过去的几年中，生物制药产业见证了巨大的突破。然而，这样的进步也伴随着无数沉重的药品生产微生物污染案例的发生。FDA披露了很多因微生物污染问题而召回的生物制品名单。FDA下属部门的CFSAN（Center for Food Safety and Applied Nutrition）在有害菌目录（Bad Bug Book）中公布了综合的病原微生物名单。此外，对微生物种群性质和相对密度的鉴定，生产上下游洁净车间灭菌方式的选择和风险评估研究也是必不可少的。

浙江省微生物研究所曾对其2017-2018年积累的我国企业环境微生物数据库数据进行了统计和分析，样本采样点绝大部分为相关企业洁净区或其他受控环境，涵盖制药、食品、化妆品等行业，其中以制药企业为主。这些微生物鉴定到种或属水平后发现细菌鉴定率为98.88%，真菌鉴定率为96.89%。

这个数据也支持近年来的法规变化即越来越多的法规、文献提及的在无菌检验方法验证、清洁和消毒剂效能验证、无菌工艺验证等等各种微生物相关的验证中，除了使用标准菌株以外，也应当使用企业自身环境中分离到的具有代表性的微生物进行相关的验证实验。

这就需要企业对环境监测中分离到的微生物进行属和种水平的鉴定（在超限时对采集到的微生物进行鉴定，以及在未超限时进行周期性的环境微生物鉴定），并且对鉴定结果进行评估，以确定常见的微生物类型，然后根据微生物的种类特征和数量从中筛选，进行相关验证实验。

①与人员携带相关：如葡萄球菌属（Staphylococcus）、 微球菌属（Micrococcus）、 短杆菌属（Brevibacterium）、 莫拉氏菌属（Moraxella）、 考克氏菌属（Kocuria）、 皮肤球菌属（Kytococcus）等，生境主要与人体相关，在这些菌属的检出率上也反映出了一定的正相关性。

人是最大的污染源，约占洁净区总污染的80%，而人总是直接或间接与药品接触。一个人在相对较轻松的工作条件下，每分钟大概释放100000个颗粒物质（颗粒大小一般为0.3微米或更大）。而在一个燥热且不舒适的环境下工作的人每分钟能够释放出上百万的颗粒物质，包括更多的细菌。

不同状态下人体表面粒子释放量

②与土壤相关：如芽孢杆菌属（Bacillus）、 类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、 赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus），这些菌属都具有较强的抗消杀能力，可能为该洁净室的土著菌属。

③与物料相关：由物料、设备包装等因素携带进入洁净环境。物料包括进入洁净室的原辅料、包装材料和其他生产用物品。物料的运输、存储环节通常是在一般环境中进行的，物料的外表面可能会被外界的尘土或微生物污染，因此进入洁净室的物料必须经过相应的生物净化处理。

对比浙江省微生物研究所2017-2018年检出率较高的菌种，发现优势菌属和菌种均十分相似。这表明尽管地域、气候等因素对菌群结构存在一定的影响，但遵循GMP体系的受控生产环境总体是具有较高的相似性，因此环境中的优势菌构成也存在着一定的相似性。制药生产环境中发现的大多数微生物是人源的革兰氏阳性杆菌和革兰氏阳性球菌，真菌则是酵母和丝状真菌。同时也有发现一些革兰氏阴性杆菌，它们通常具有条件致病性，如粘质沙雷菌（Serratia marcescens，又称褪色沙雷氏菌）。

虽然相比于自然环境，洁净环境的微生物种类更少，优势菌群占比更高，菌群面临的生存胁迫更大，但洁净环境的微生态仍具有其独特的多样性和稳定性。虽然存在地域差异、产品差异等因素，但各企业洁净环境中的优势菌群仍具有一定的相似性，且在一定程度上遵循“二八原则”，既20%的优势菌属占总检出率的80%。

灭菌一直以来都是无菌药品生产过程中的关键环节，新版GMP也对无菌药品的生产提出了更高的要求。为了提高产品的质量，选择合适的灭菌方式显得尤为重要。在当前各种灭菌技术当中，气化过氧化氢灭菌被公认为理想的灭菌方式。

过氧化氢自身是一种消毒剂，主要通过氧化作用灭菌，灭菌过程低温、低湿、快速，分解后无残留毒性，完全符合未来灭菌设备的发展方向。利用物理手段使过氧化氢迅速气化，过氧化氢在常温下的气体状态比液体状态具有更强的杀孢子能力，经生成游离的氢氧基，用于进攻细胞成分，包括脂类、蛋白质和DNA，达到完全灭菌的要求。不同类别微生物对过氧化氢的抗性强度（降序）：细菌芽孢、分枝杆菌、小型无包膜病毒、革兰氏阴性菌、真菌、大型无包膜病毒、革兰氏阳性菌、包膜病毒。因此，气化过氧化氢灭菌可以轻松杀灭药厂环境中的各种微生物。

采用非最终灭菌方式生产的无菌药品一般是不耐热且不能进行成品灭菌的，所以必须特别强调药品生产过程中的无菌操作。其生产作业区的无菌操作与非无菌操作应严格分开，所有从非无菌操作区进入无菌操作区的原液，物料以及器具必须经过严格灭菌。洁净区与非洁净区，级别低的洁净区与高级别洁净区之间运送物料或器具所选用的传递窗应本着节能、灭菌均匀、速度快、安全性好、操作简单、性能稳定、可靠性好的原则。

德国PEA独立开发的气化过氧化氢传递窗，通过集成的气化过氧化氢发生器对被传递物品的所有暴露表面进行灭菌，取代传统紫外消毒的方法，使用该方法灭菌更彻底，能达到6-log的杀灭率。且传递窗自带的高效过滤器层流保护和双门互锁功能，可有效防止交叉污染。过氧化氢传递窗在欧美发达国家已成熟应用，气化过氧化氢灭菌低温、常压，适用于低温灭菌的产品。气化过氧化氢具有良好的物料兼容性，易分解，无有害残留，最终分解为水和氧气。