慢病毒，一个强大的转基因及基因调控工具。KnockGene慢病毒载体元件丰富，能很好地针对长ORF的基因设计包装病毒，提高转染效率，满足后续实验要求。我们擅长，根据您的课题需求，设计构建多方位研究基因功能的慢病毒载体。好的载体，让您的后续实验高枕无忧。

我们可为您设计，有以下要求的载体：

u  过表达，调控表达（对表达量有比较严格的要求）

u  敲低，RNAi，CRISPR

u  稳定转染，永久转染，传代细胞转染，原代细胞转染，在体转染

u  单载体CRISPR

u  多基因表达，长ORF

u  组织特异性表达，靶向性转染，cell targeting

u  非整合型慢病毒

u  全实验过程中涉及多个筛选基因的设计

u  全实验过程中涉及多个报告基因的设计

u  基因治疗载体的优化

除了设计各种难以程度不同载体之外，我们也乐于为大家提供实验方面的咨询，分享我们团队十多年来在各类实验中积累的经验，帮助大家克服实验中遇到的问题。欢迎联系：18610598977  /  010-80765889

案例1 端粒酶逆转录酶（TERT）的表达

端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）编码端粒酶的一个催化亚基，功能在于在染色体端粒末端加入特定的核苷酸序列，从而防止染色体在复制过程中发生降解。在细胞内表达TERT是一种诱导细胞永生化的方法。

客户需求：构建表达人TERT基因的病毒质粒，并制备病毒转染原代细胞。

难点：人TERT基因编码区为3396bp，基因本身比较大，通常构建到慢病毒载体中后，由于载体太大，包装的病毒滴度比较低，用于转染原代细胞会比较困难。

结果：使用我们的病毒载体构建了TERT的表达质粒，TERT基因由CMV启动子驱动表达，载体中带有puromycin抗性基因用于转染后筛选。由于我们的病毒载体较小，装入TERT基因后并未对病毒包装造成太大的影响，包装的初始病毒滴度可以达到10⁶TU/ml以上，浓缩后可以达到10⁸ TU/ml以上，客户拿到病毒以后顺利完成细胞转染以及筛选，获得了稳定表达TERT基因的细胞。

案例2  超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）的表达

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）主要存在于心肌细胞上，在控制心率中起着比较重要的作用，在心律失常的研究中经常被涉及。

客户需求：已经在其他公司构建了HCN4的表达病毒载体，但是只带有GFP标记，而且GFP荧光较弱，不便于筛选，希望能够改进。

难点：HCN4本身基因长度有3606bp，在这种情况下加入GFP标记并且成功包装出病毒已经不太容易，要提高荧光强度并且再加入筛选标记更加困难。

结果：使用我们的病毒载体构建了双启动子的HCN4表达质粒，将HCN4和标记基因用不同的启动子表达。此载体带有GFP便于观察，带有puromycin便于筛选。载体已经很大，并且确实对病毒滴度也造成了一些影响，包装的初始病毒滴度在5*10⁵左右，经过浓缩以后，仍然完全满足客户的需求，成功进行了原代细胞转染。

案例3  有表达水平需求的双基因表达

客户需求：客户自己提供两段基因序列，需要在同一个载体上进行表达，并且不需要表达量太高，两个基因表达强度不要相差太大，需要带有筛选标记。

难点：同时表达两个基因，加上一个筛选标记基因，总共3个基因，本身难度不大。但是客户需要目的基因维持在一个较低的水平，就比较难于控制。

结果：针对这一要求，我们构建了双向启动子的表达病毒载体，两个目的基因由双向启动子驱动表达，抗性基因单独表达。由于客户其他载体上已经使用了puromycin和Blasticidin的抗性，这个载体选择了用Neomycin进行筛选。此载体病毒包装完全正常，转染细胞以后表达也符合客户的要求。

案例4 原代造血干细胞中CRISPR基因敲除

客户需求：在分离的原代造血干细胞中，使用CRISPR技术敲除掉目的基因，并且要尽可能的花更少的时间完成这一目的。

难点：   CRISPR的慢病毒由于Cas9基因本身比较大，达到4100bp以上，因此通常是采用双病毒载体，一个载体表达Cas9，另一个载体表达sgRNA，对细胞转染两次以后才能完成基因敲除。对于原代造血干细胞来说，本身体外培养时间有限，前面两次转染和筛选会消耗大量的时间，使得后面没有足够的时间完成实验。有一些慢病毒载体可用于单载体CRISPR应用，例如常见的LentiCRISPRv2，但是这些载体包装的病毒滴度太低，通常只有10⁵TU/ml量级，对于本来难转的原代细胞就很麻烦。

结果：使用我们独有的单载体CRISPR，构建了两个靶点的病毒载体，并且包装病毒。初始滴度均能达到10⁶ TU/ml以上。浓缩以后能够成功的转染细胞，使用载体带有的puromycin抗性进行筛选，获得稳定转染敲除病毒的细胞。在转染后7天的时候取细胞进行WB分析，两个靶点均有效的完成了目的基因的敲除，分别达到70%和90%以上。此载体在不需要单克隆筛选的情况下即完成了基因敲除，使这些难于实现的实验变得可行。

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途