TALEN技术制备基因敲除小鼠（大鼠）

一、技术原理 
        TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技术是基于对DNA识别域 (TALEN 结合臂) 和人工改造的核酸内切酶的切割域(FokⅠ)的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TALEN的DNA识别域是由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块由34个氨基酸组成，其中第12和13位的氨基酸种类为可变的（RVDs），且决定了该模块识别靶向位点的特异性。通过DNA识别域结合到靶位点上，以及FokI的切割域形成二聚体后，可特异性对目标基因DNA实现切断，在非同源末端连接修复过程中，DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。 该技术目前已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类模式动物的研究领域。
 
二、技术特点： 
        1、可以应用于大小鼠；无动物品系限制，永久失活；
        2、成功率可达90%以上；
        3、实验周期短、价格低 。
 
三、制备流程及服务周期 
        设计、构建Talen质粒（2周）→TALEN质粒体外转录成mRAN（1周）→mRAN原核显微注射(F0代鼠生产) （4周）→F1代鼠生产（12周）

四、服务承诺 
        赛业生物科技承诺提供4只F1代大鼠。

五、TALEN 技术流程图 
         TALEN由四部分组成：N端序列，RVD，C端序列，FokI。利用Type II限制性内切酶可以将RVDs模块分别生成不同的粘性末端，同时又不留有酶切位点， 通过一系列的相应酶切连接反应实现RVDs与TALEN骨架的无缝连接。 
       TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。FokI形成二聚体发挥活性，在TALEN结合臂的引导下，发挥特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞通过NHEJ（Non- homologous End Joining）修复DNA，在此修饰过程中导致删除或插入了一定数目（非3的倍数）的碱基，造成移码，形成对目标基因特异性KO的突变体。 
 

六、Cygen 利用TALEN技术成功构建 IgM KO Rat 案例：

SD Rat IgM Knockout(TALEN)

T TCCTGCCCAGCTCCAT ttccttctcctggaact  ACCAGAACAACACTGA  A
TAL1 RVDs：NG HD HD NG NN HD HD HD NI NN HD NG HD HD NI NG 
TAL2 RVDs：NG HD NI NN NG NN NG NG NN NG NG HD NG NN NN NG  

结果：Sequencing confirmation of disruption of  the Rat IgM by TALEN

突变型1、突变型2、野生型
结果说明： 
突变型1: 缺失12 bp；
突变型2: 缺失5 bp。

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公司简介

赛业生物科技集团是全球领先的多元化跨国生物科技实体，2006年成立于美国，中国区总部设立在广州，集团成员包括 Cyagen Bioscience Inc.、赛业（广州）生物科技有限公司、赛业（苏州）生物科技有限公司、赛业健康研究中心（太仓）有限公司等。目 前员工人数达400余名，总规模超22000平方米，业务经营范围涵盖模式动物、细胞生物学、分子生物学、生物信息学、体外诊断等生命科学领域的多个分支 学科。

作为全球领先的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台，赛业模式动物中心动物种群规模超过10万只，每年可构建基因敲除鼠模型500例、转基因 鼠模型5000例以上，学术引用累计超过600篇，是目前国际上zei主要、zei被认可的基因工程模式动物商业服务平台之一。自主开发的全球首款功能强大的在线 载体设计工具VectorBuilder，每年可定制载体超30万个，彻底颠覆生物技术领域传统格局，打造载体构建金标准和新模式。

2009年，赛业通过ISO9001:2008认证并于2012年顺利通过复审，确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准。 AAALAC认证的顺利通过，使赛业成为华南地区极少数个获得国际实验动物评估和认可委员会国际认证的单位之一。这不仅是实验动物质量和生物安全水准的象 征，更是国际前沿医学研究的质量标志。

赛业公司目前在美国加州Santa Clara 建立起活体实验鼠检测、隔离中心，成为国内唯一一家具有活体实验鼠类出口能力的生物企业；通过国家出入境检验检疫部门的考核，成为华南地区第一家生物材料 出入境绿色通道试点单位，加速了实验动物出入境审批流程，并进一步提升了赛业模式动物中心国际服务的能力。

目前公司的产品和技术服务已为全球数百个顶尖生命科学实验室和跨国制药公司提供了帮助，秉承着“为生物科技创造无限可能”的企业愿景服务于全世界的科研学者！

专家团队介绍 

欧阳应斌 博士（赛业生物技术副总裁、高级科学家）

 
        欧阳应斌博士，国际知名的分子生物学和模式动物专家，1993年于军事医学科学院博士毕业后，二十多年来一直身居美国致力于分子生物学和基因工程模式 动物研究，先后就任于Indiana大学医学院、Oklahoma医学研究基金会和美国首屈一指的模式动物商业机构Taconic生物科技公司。

        目前任职于跨国生物技术实体Cyagen Biosciences（赛业生物科技），担任技术副总裁和高级科学家，由其率领的科学家团队数年来成功开发了上千种转基因、基因敲除/敲入小鼠及大鼠实 验动物及疾病模型。在PNAS、JBC等高水平杂志发表论文10余篇，由其提供的技术服务被Nature等国际顶尖杂志直接引用达数百次之多。

俞晓峰 博士（赛业生物技术总监、高级科学家） 
 
        俞晓峰博士，国际知名模式动物和细胞生物学专家，1995年军事医学科学院博士毕业，2000年起任耶鲁大学医学院研究员。2003至2009年期间 任职于美国 iTL 基因打靶公司，作为资深科学家和项目经理，负责基因工程小鼠模型研发方案与策略的设计，项目的管理，技术人员的指导与培训等工作。2007年起负责开发了 人源化 p53 基因不同点突变的肿瘤小鼠模型库项目。2009年起任纽约大学医学院研究员。

        2010至2013年期间担任美国 ASC 生物技术公司研发部总监，模型生物服务部总监，以及斯坦福生物公司总裁等职务，目前任职于跨国生物技术实体Cyagen Biosciences（赛业生物科技），担任技术总监和高级科学家。俞博士在遗传工程小鼠领域有超过 15 年的开发和管理经验，在干细胞相关领域和哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志上。

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途