TA克隆

基因克隆

亚克隆

定点突变

质粒载体改造

cDNA文库构建

1.TA克隆

定义

        把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'端加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。　

        通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP），72℃10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。

实验材料要求

1、未纯化的PCR产物及PCR电泳图片

2、PCR扩增引物序列

3、 PCR扩增用酶如果使用含3'→5'外切酶活性的聚合酶，请提供PCR引物，我们将重新扩增PCR产物以保证能行TA 克隆操作。

服务说明

1、PCR产物TA克隆实验中，PCR片段越大，TA克隆难度越大；

2、TA克隆实验中，我们使用的是大家常用T载体作为标准T载体，如果对载体有特殊要求，请再实验之前告知客户服务人员。

终产品

提供一份冻干后的送测质粒，相应测序结果及穿刺菌，pMD18-T载体图谱和序列，TA克隆实验报告

2.基因克隆

定义

        基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为基因操作或重组DNA技术。基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。

基因克隆的一般流程

1、目的片段和载体的制备（从组织或细胞中提取基因）

2、目的片段和载体的连接

3、连接产物的转化

4、重组子的筛选

5、测序鉴定

服务内容

1、以质粒、基因组DNA、cDNA、PCR产物等为模板PCR扩增目的基因。

2、PCR产物TA克隆。

3、重组质粒测序。

服务说明

1、本公司可以免费提供TA克隆载体，如需要特殊载体请您自己提供。

2、设计PCR扩增引物时如需引入酶切位点，请提前告知。

终产品

1、克隆构建的质粒及含有该质粒的菌种；

2、完整实验报告(包括具体实验步骤、照片等)。

3、测序彩色波形图、序列碱基图、酶切位点图。

3.亚克隆

定义

       亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。

亚克隆的一般流程

1、目的DNA片段和载体的制备（目的基因从另外的基因大片段或质粒载体中获得）；

2、目的DNA片段和载体的连接；

3、连接产物的转化；

4、重组子筛选。

服务内容

1、将含有目的基因的质粒采用双酶切的方法克隆至商品化的表达载体或改造后的特殊载体上。

2、将载体上的目的基因进行PCR扩增并加入酶切位点后，克隆至商品化的表达载体或改造后的特殊载体上。

3、利用PCR、酶切等手段对已有载体进行改造。

服务说明

送样时，请注意   

1、原始模板信息：序列名称、载体名称、载体抗性、插入片段大小、是否对需要亚克隆的序列进行测序（若已测序，请提供测序报告；若未测序，需另加收测序费用）。

2、亚克隆方式：5’ 酶切位点信息、3’ 酶切位点信息、目的载体信息（名称、抗性、大小、是否经过改造）。如果目的载体经过改造，请提供改造后的全序列以及测序峰图；或至少提供插入位点上下游各500bp以上的测序报告。

3、目的序列信息：两端加好酶切位点的目的序列。

终产品

1、克隆构建的质粒及含有该质粒的菌种；

2、完整实验报告(包括具体实验步骤、照片）等；

3、分析报告、测序图谱、质粒构建图、序列比对文件。


4.定点突变

定义

        通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

一般实验流程　

1、对待突变基因测序结果进行分析，设计突变方案；

2、根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应；

3、默认情况下，将PCR产物克隆至T载，或者根据要求亚克隆至目的载体；DNA测序验证突变序列的正确性。

服务要求

1、我们会对需要突变的质粒进行测序验证，以确保与您提供的原始序列真实一致，如果客户已经测序验证过，请提供测序峰图文件。

2、在不涉及研究课题隐私的情况下，请尽量提供待突变的质粒图谱，便于我们设计实验定点突变实验方案。

3、定点突变一般须有含有待突变基因的高纯度质粒，不少于10μg，电泳图清晰，达酶切及测序要求。

服务说明

从修复突变的操作层面来说，相邻10个碱基以内的两个突变，可以在一次修复实验中完成，因此只收取一次费用，客户需要提供含有目的基因的质粒或菌液，原始质粒的测序图谱，突变后序列及载体信息的相关资料。

终产品

1、QC报告单一份

2、含目的基因的质粒

3、含有突变后的菌株

4、突变后质粒的测序图谱
 

5.质粒载体改造

定义

      DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆，载体上常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等。

服务内容

1、已有载体多克隆位点MCS的改造。

2、已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。

服务说明

1、如载体由客户提供，则客户需要提供足量高纯度的质粒（>5ug，电泳图清晰，达酶切测序要求）及本公司鉴定工作所需的材料。

2、客户应保证所提供原材料即基因模板的正确性。如基因模板本身具有移码突变或其它无义碱基突变，由此造成的实验时间延误、重复实验费用或其它经济损失均由客户承担。

终产品

1、克隆构建的质粒及含有该质粒的菌种；

2、完整实验报告(包括具体实验步骤、照片）等；

3、分析报告、测序图谱、质粒构建图、序列比对文件。

6.cDNA文库构建

定义

      含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

一般实验流程

1、反转录酶催化合成cDNA第一链

2、cDNA第二链的合成

3、cDNA的甲基化

4、接头或衔接子的连接

5、Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

6、cDNA与λ噬菌体臂的连接

注意事项

1、RNA 的提取（例如异硫qing酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。

2、要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。

3、由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。

4、文库构建要选择合适的载体，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。

5、胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

6、胶回收时电压要稳定。

服务说明

1、请提供组织（100～200mg）、细胞（>106）、总RNA（>1μg）。

2、为保证后续文库构建能及时完成，请提供两次以上的样品需求量。

3、请务必保持样品新鲜，RNA无降解。

4、植物材料应尽量选取幼嫩部位，避免过老的组织。

5、请尽量提供物种基因组背景资料信息，如：基因组大小，基因平均长度，预计表达的基因数量等。

终产品

1、文库连接液，保存在－20℃

2、实验报告：文库评价数据（库容量，插入片段平均长度，重组效率，cDNA完整性评价，冗余度评价）、实验流程、产物电泳图谱及均一化前后管家基因对比图

分子克隆信息由上海格索普生物科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于分子克隆报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途