双荧光素酶报告基因检测

双荧光素酶验证转录因子与启动子结合位点

双荧光素酶验证miRNA与靶目标基因结合位点

双荧光素酶验证转录因子与启动子结合位点

        转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现相互结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到萤光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则萤光素酶基因就会表达，萤光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3）加入特定的萤光素酶底物，萤光素酶与底物反应，产生萤光素，通过检测荧光的强度可以测定萤光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

双荧光素酶验证miRNA与靶目标基因结合位点

        双萤光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种萤光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内参，为实验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。利用双萤光素酶报告基因检测系统可以对miRNA与靶目标基因结合位点，转录因子与启动子结合位点提供验证服务。

        由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（检测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点基因突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

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