10×单细胞转录组测序

华银健康｜开学季，签单送豪礼
活动时间：9月1日-10月1日
10X 单细胞转录组测序、m6A 甲基化测序、全转录组测序
活动期间，达到签单要求的客户均可享受华银健康高通量测序VIP价格，签单金额高，享受的优惠幅度越大！



传统的高通量测序是对某一组织整体的细胞合集进行测序和分析，而某一个细胞的基因信息则会被整体覆盖。随着高通量测序技术的发展，人们对基因组与表型之间的关系认识越来越深刻，单个细胞也有可能携带重要的信息。
10x单细胞测序是使用10x genomics平台，将单细胞悬液中的每个细胞分别进行标记，再通过逆转录和PCR建库测序，分析单个细胞的转录组信息。单细胞测序可以揭示复杂细胞群体的异质性，避免单个细胞的基因表达信号被群体的平均化所掩盖。


1、10×单细胞转录组测实验方案
     测序策略：Illumina 平台  PE150
     数据量：数据量与捕获的细胞数量相关，捕获细胞越多，产生的数据量也越多，具体如下：

捕获细胞数量

平均每个细胞raw reads数

数据量

2000-5000

40~100k

60G

5000-7000

40~60k

90G

7000-10000

40~60k

120G

2、单细胞转录组测技术优势
（1）精准分选：利用10X Genomics平台，实现真正的单细胞测序；
（2）细胞捕获率高达65%，可实现大量大细胞的快速高效标记、测序和分析；
（3）项目周期短，技术应用范围广。

4  单细胞转录组测信息分析
1 测序数据质控和定量

1.1 测序序列统计与质控

1.2 数据定量

1.3 多样本数据合并和定量均一化

1.4 最终鉴定细胞表达量矩阵

2 细胞亚群分类
2.1细胞过滤
2.2单细胞亚群分类
3 Marker基因分析
4 差异富集分析
4.1差异基因GO富集性分析
4.2 差异基因KEGG富集性分析
5 高级分析
5.1 已知基因在细胞亚群表达分布及热图
5.2 细胞分化拟时序分析
5.3 细胞相互作用图谱
5.4 加权基因共表达（WGCNA）分析
5.5 蛋白质互作网络分析
5.6 细胞周期鉴定


4、技术流程

5、单细胞转录组测案例分析
案例（1）Nature | 对可重复形成人体大脑皮层的“微型人脑”单细胞多样性研究

通过对LN患者和健康个体的肾脏、血液和尿液样本进行单细胞转录组测序分析，结果显示，血液与肾脏中检测到的细胞分子特征存在相似性和差异性，而尿液与肾脏中白细胞亚群的分子活化状态高度相关，有望作为肾脏活检的代替物。使用低分辨率聚类将所取肾脏细胞分为了10个集群，基于谱系标记基因和其他基因上调，将集群标记为髓细胞（C4,C6）、T/NK细胞（C0,C1,C2,C5）、B细胞（C3,C8）、分裂细胞（C9）和肾上皮细胞（C7）。接下来，将每个谱系的细胞分别进行聚类，一共确定了21个免疫细胞集群和一个上皮细胞集群（图2）。 

案例（2）Nature Immunology | 狼疮性肾炎患者的肾脏免疫细胞组成单细胞测序分析
 

通过对LN患者和健康个体的肾脏、血液和尿液样本进行单细胞转录组测序分析，结果显示，血液与肾脏中检测到的细胞分子特征存在相似性和差异性，而尿液与肾脏中白细胞亚群的分子活化状态高度相关，有望作为肾脏活检的代替物。
使用低分辨率聚类将所取肾脏细胞分为了10个集群，基于谱系标记基因和其他基因上调，将集群标记为髓细胞（C4,C6）、T/NK细胞（C0,C1,C2,C5）、B细胞（C3,C8）、分裂细胞（C9）和肾上皮细胞（C7）。接下来，将每个谱系的细胞分别进行聚类，一共确定了21个免疫细胞集群和一个上皮细胞集群（图2）。
研究利用单细胞转录组学研究从LN患者和活体供体对照中获得的肾脏样本，揭示了LN肾脏免疫群体的复杂性，识别了髓细胞、NK细胞、T细胞和B细胞等多种疾病特异性亚群。研究发现： 大量的分裂细胞和NK细胞,表明IFNγ和细胞溶解分子的主要来源，CD8+T细胞中衰竭标记的少量表达表明了LN中的细胞毒性。浸润白细胞的干扰素反应特征与血液中，趋化因子受体CXCR4和CX3CR1在肾脏免疫细胞中频繁表达，提示它们可能是潜在的治疗靶点，尿液免疫细胞基因表达与相应的肾脏白细胞高度相关。





参考文献
[1] Arazi, A., Rao, D. A., Berthier, C. C., Davidson, A., Liu, Y., … Diamond, B. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.
[2] Velasco, S., Kedaigle, A. J., Simmons, S. K., Nash, A., Rocha, M., Quadrato, G., … Arlotta, P. (2019). Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature, 570(7762), 523–527.

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