10×单细胞免疫组库测序

                       T淋巴细胞（T cell）和B淋巴细胞（B cell）主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于T细胞受体（T cell receptor, TCR）和B细胞受体（B cell recptor, BCR），这两类细胞表面分子的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子。BCR的重链和TCRβ链由V、D、J、C四个基因片段组成，BCR的轻链和TCRα链由V、J、C三个基因片段组成，这些基因片段在遗传过程中发生重组、重排，组合成不同的形式，保证了受体多样性。
传统免疫组库研究方式局限性较大，10xGenomics新推出的“单细胞免疫谱分析”利用其微流控芯片制备单细胞体系，选择5'端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行V(D)J富集，实现在单细胞水平，对成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）进行全长测序，为免疫组库全面、系统的研究提供了高效的技术平台，对疾病发生、发展的分子机制研究有重要的意义。

图1. 10xGenomics单细胞系统

1 技术原理

10xGenomic单细胞免疫组库测序是建立在GemCode技术上的微流体平台，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA。液体油层破坏后，cDNA一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库文库构建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通过设计在TCR或者BCR的C区域的巢式PCR引物进行富集。然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据，实现在单细胞水平同时对基因表达和免疫组库进行研究。

图2 . V(D)J重组产生TCR、BCR多样性

2 样本要求

◆ 样品类型：新鲜人或小鼠细胞悬液、血液（全血、PBMC等）；
◆ 细胞来源：血液提取、磁珠富集、流式分选、组织解离；
◆ 细胞大小：小于40um；
◆ 细胞总量：细胞悬液，一个样本细胞起始量约1x105个。
◆ 质量要求：细胞活性大于85%，理想浓度为1000个/ul(500~2000个/μl)。
◆ 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca2+和Mg2+等影响酶活性的物质。

3 实验流程

利用10xGenomics平台完成单细胞的分离、反转录成cDNA后，选择不同的研究目的进行文库构建：5’基因表达文库、TCR的V(D)J文库或和BCR的V(D)J文库。将cDNA分成2份或3份同时进行TCR/BCR的V(D)J富集、文库构建、测序和5’单细胞转录组文库构建、测序，获得每个细胞表达谱和V(D)J全长序列，获得数据进行细胞亚群聚类、细胞表达特征和标记分子筛选等分析。

图3.  5’单细胞表达谱和V(D)J免疫组库实验流程



图4.  5’单细胞表达谱和V(D)J免疫组文库的比较



表1.  5’单细胞表达谱和V(D)J免疫组文库及测序参数

4 分析内容

测序数据质量控制；

比对与注释：样本基本信息结果统计，样本contig注释信息结果统计，样本Consensus序列注释信息结果统计；

Clonotype分型；

特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；

多样本分析：样本间Clonotype比较，Overlapping Clonotype聚类分析，Overlapping Clonotype差异分析。

5 技术优势

可实现配对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序；

精确到单细胞水平，能获得大量单细胞的免疫组数据；

大规模单细胞VDJ+表达谱测序，单个细胞成本大大降低；

同时获得5’gene expression的单细胞转录组数据，可与免疫组数据联合分析

6 案例分享

Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
CELL影响因子: 30.41   Elham Azizi at el. 2018.

了解肿瘤微环境中免疫细胞的表型，对于癌症进展和免疫治疗反应的研究至关重要。研究者使用单细胞RNA测序分析了来自8位原发性乳腺癌患者的45,000个免疫细胞，同时也添加了正常乳腺组织、血液和淋巴结中的免疫细胞作对照。研究者开发了预处理流程SEQC和贝叶斯聚类和归一化方法Biscuit，用来解决单细胞数据固有的计算难题。研究中观察到正常免疫细胞与肿瘤组织中免疫细胞之间有显著相似性，但后者针对肿瘤微环境出现特异性连续表型扩展。对来自另外27,000个T细胞的成对单细胞RNA和T细胞受体（TCR）测序，结果揭示了TCR组合使用对表型多样性的影响。研究结果支持T细胞连续活化模型，但不符合癌症中的巨噬细胞极化模型。本研究结果对表征肿瘤浸润免疫细胞具有重要意义。

华银健康高通量测序检测中心
中心定位于科研服务与临床医学转化应用，致力于生物医学各领域的相关研究与测序大数据联合分析，为各大高校、医院和科研单位提供医学科研项目的实验设计、测序方案和数据分析为一体的一站式服务。形成以临床应用为导向的转化医学中心，力争为客户提供专业、快速的临床医学检测服务。
目前，华银高通量检测平台拥有Illumina和Thermo Fisher等高通量测序仪组成的大规模高通量测序服务平台，科研服务可提供涵盖外泌体组学、免疫组学、基因组学、转录组学、微生物组学、蛋白组学和代谢组学等各种测序服务和高级生物信息分析服务；临床检测服务包括遗传性肾病全谱基因检测、临床病原微生物检测、肿瘤分子病理检测等服务。

10×单细胞免疫组库测序信息由广州华银健康科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于10×单细胞免疫组库测序报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途