双荧光素酶报告基因实验

                       一、 实验原理：
双荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）目前由两个主要的应用方向，第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的研究方法。
1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）
2） 将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

二、实验步骤（动物）：
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2） 设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。
（3） 筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。
（5） 培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于6孔板中，生长24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7） 用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。

实验步骤（植物）：
1. 挑取单克隆于LB液体培养。
2. 将农杆菌转接到LB液体培养基中（加有与1相同的抗生素）。加入乙酰丁香酮和MES，28度摇床培养。
3.离心收集菌体。
4. MgCl2重悬菌体加入AS。
5. 取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔。
6. 将侵染液装入5 ml 注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后荧光素酶检测试剂盒（Dual-Luciferase Assay System, Promega公司）（具体步骤详见说明书）在promega发光检测仪（Promega Glomax 2020）分析荧光素酶活性。
8. 根据双报告系统测得的荧光值，算出目的基因质粒的荧光值/内参质粒荧光值（即F/R值），并算出相对于对照组的比值，求出标准误，作出直方图。

三、实验结果：
promega发光检测仪测出的原始数据和根据原始数据做出的直方图。


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