CRISPR/Cas9文库功能基因筛选整体解决方案

                              CRISPR/Cas9系统是当今基因编辑领域最热门的明星工具，2013年，Broad研究所的两个研究团队分别在Science杂志同一期上发表了CRISPR文库的相关研究。在此之后，基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速发展，CRISPRa，CRISPRi及CRISPR敲除文库已经广泛用于证明新的生物学机制，如耐药性和细胞存活信号。多篇CNS(Cell、Nature、Science)连续报道。利用该技术，研究人员在药物靶标发现、基因功能研究、药物敏感基因研究等领域取得了巨大的成功。

1、服务内容（以耐药基因为例）

1）临床问题提出，选定合适的研究目标，确定研究癌种与目标药物。
2）个性化设计，全基因组筛选可能与药物发挥拮抗作用的基因。
3）高通量测序及候选基因筛选
4）候选基因功能验证：细胞水平、动物水平，临床相关性等
5）数据库检索寻找候选增敏基因的小分子抑制剂，如有可进行成药性研究，验证药物协同作用。

2、一般筛选流程（耐药基因为例）

3、筛选优点

快速准确的找到与某种表型相关的基因
靶点效率高
应用范围广
开发潜力大
4、现有CRISPR筛选文库

人源lncRNA 激活库Human CRISPR lncRNA Activation Pooled Library (SAM-3)

1、靶向激活10,504个lncRNA

2、包含96,458个sgRNA靶点

人源敲除库Human CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2) 

1、靶向敲除19,050个mRNA 及1864个miRNA

2、包含123,411个sgRNA靶点

人源激活库Human CRISPR Activation Library (SAM-2)

1、靶向激活23,430个mRNA

2、包含70,290个sgRNA靶点

小鼠敲除库Mouse CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2)

1、靶向敲除20,611个mRNA 及1175个miRNA

2、包含130,209个sgRNA靶点

小鼠激活库Mouse CRISPRa sgRNA library Caprano (P65-HSF)

1、靶向激活22,774 (Set A), 22,658 (Set B) 个mRNA

2、包含134,076个sgRNA靶点

其他个性化定制 CRISPR/cas9 慢病毒文库

5、筛选案例

1）药物靶标发现

Molecular Cancer（If 7.776）杂志8月份在线发表了广州市第一人民医院的文章，伊马替尼是一种治疗白血病及胃肠道间质肿瘤的药物，但往往产生耐药，机制不明。在该研究中，研究人员运用CRISPR/Cas9全基因敲除文库在胃间质瘤中筛选并验证了9个可能参与伊马替尼耐药的基因，可以用于深入探讨伊马替尼耐药的分子机制。

“筛选”耐药基因的思路

耐药基因筛选、差异基因的通路富集分析

耐药基因功能验证

Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor
with Imatinib resistance. Molecular Cancer. 2018; 17(1):121-127.

     2018年4月份哈佛大学研究团队在Cell杂志发表了运用CRISPR激活文库筛选了化疗耐药相关的lncRNAs的研究论文。阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一种治疗AML的药物，但往往产生耐药，机制不明。作者利用CRISPR文库原理构建了同时筛选有功能的mRNA、lncRNA的sgRNA筛选技术，通过“随机激活lncRNA、mRNA的转录表达”的方式，筛选针对AML的阿糖胞苷耐药RNA。最后发现lncRNA GAS6-AS2的激活会介导耐药的产生，并通过体内、外实验验证这一发现。

技术路线

耐药基因筛选策略、差异基因的通路富集分析

富集lncRNA的关联通路注释

GAS6-AS2耐药：体外功能验证，预后分析

GAS6-AS2耐药：体内验证

An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018; 173(3):649-664.e20.
 

2）自噬相关基因筛选

自噬是一种细胞内降解过程，需要多个自噬相关（ATG）基因的参与。在这个研究中，东京国立癌症中心研究所采用自噬流体报告基因GFP-LC3-RFP进行了全基因组CRISPR文库筛选，并鉴定出新的ATG家族基因TMEM41B，并发现TMEM41B与VMP1在自噬体形成的早期阶段一起发挥作用。

GFP-LC3-RFP全基因组筛选思路

TMEM41B敲除对自噬的影响

Genome-wide CRISPR screen identifies TMEM41B as a gene required for autophagosome formation. J Cell Biol. 2018; 217(11):3817-3828.

3）肺转移基因筛选

Cell杂志发表的张峰团队的研究论文，该研究采用“全基因组CRISPR敲除文库”，经过慢病毒库扩增后，感染肺癌细胞株，经筛选后接种到裸鼠皮下，定期观察直至其肺部生成足量转移灶，取肺组织并提取基因组，PCR产物进行高通量测序获得肺转移相关基因，并进行实验验证。

筛选思路

肿瘤生长及转移情况

原发性肿瘤基因富集分析       转移瘤基因富集分析

单基因体内验证

Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015; 160(6):1246-60.

 

4）免疫相关基因筛选

哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所等研究团队通过CRISPR文库体内筛选，鉴定出免疫相关基因Ptpn2，抑制Ptpn2可能会增强引起IFNγ反应的免疫疗法的效果，Ptpn2有望作为新的免疫治疗靶标。  

筛选策略

体内实验验证筛选到靶标Ptpn2

Ptpn2缺失使肿瘤对免疫疗法敏感

In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 2017; 547(7664):413-418.


其他相关文献

A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma. Cell Res. 2018.

Genome-wide CRISPR screen for PARKIN regulators reveals transcriptionalrepression as a determinant of mitophagy. Proc Natl Acad Sci. 2018.

An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell.2018.

Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells. Nat Cell Biol. 2018.

TRRAP is essential for regulating the accumulation of mutant and wild-type p53 in lymphoma. Blood. 2018.

LKB1, Salt-Inducible Kinases, and MEF2C Are Linked Dependencies in Acute Myeloid Leukemia .Mol Cell. 2018.

Genome-wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS. Cancer Cell. 2018.

CRISPR-Cas9 screen reveals a MYCN-amplified neuroblastoma dependency on EZH2. J Clin Invest. 2018.

Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout and Transcriptional Activation Screening. Nature Protocols, 2017.

Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature, 2017.

Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. Elife, 2016.

Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature biotechnology, 2016

A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell, 2015 

High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell, 2015 

Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science, 2015.

Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature biotechnology, 2015

Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015.

High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature, 2014

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