肠道菌群相关疾病研究整体方案

1、肠道菌群概述

健康人的肠胃中寄居着很多微生物，这些微生物统称为肠道菌群，人体肠道微生物约有30个种属，300-500多种，是人体细胞总数的10倍。主要包括细菌群、真菌群、古细菌群、病毒群及原虫等，其中数量最多的细菌群，包括厌氧菌、需氧菌和兼性厌氧菌。肠道菌群并不是一个孤立的存在，作为一个长期以来被忽略的“器官”，参与人体生命活动的各个途径，包括血管生成、免疫系统的成熟和稳态、神经调节、脂肪储存，某些维生素、类固醇激素和神经递质合成、药物代谢、食物消化和营养吸收、骨骼生成及骨代谢等。这些功能及其对应的pathway可以为肠道菌群相关机制的研究提供依据。

目前和肠道菌群相关的疾病研究多为以下几类：1）消化道类疾病，包括腹泻、便秘，肠易激综合征、炎症性肠炎IBD等；2）代谢性疾病，包括肥胖、二型糖尿病T2D等；3）肝脏类疾病，包括肝硬化、脂肪肝、酒精肝等；4）免疫类疾病，包括类风湿性关节炎、强制性脊髓炎等；5）肺部疾病，包括哮喘、慢性肺病、肺部感染等；6）精神类疾病，包括自闭症，抑郁症、老年痴呆、精神分裂；7）肿瘤，包括结直肠癌、肝癌等。

菌群生态系统的结构和功能也是目前生命科学和医学领域的研究热点，2018年医学科学部及生命科学部共计有165项肠道菌群相关的研究获得了资助，资助金额为8093万元，较去年增加75%！

2、服务内容

群体选择

可以直接选择临床疾病组和健康组来进行研究，如果有疾病进展信息或药物干预情况，我们可以增加相应的分组，以获得更多的信息。
如果临床病例的获得有一定难度，也可以选择构建疾病动物模型获取样本，干预药物及干预时间根据研究目的合理设计。

样本选取

粪便样本代表肠腔微生物，由于取样简单、样本量大，是我们目前研究的主要样本来源。
肠粘膜样本代表肠粘膜定植微生物，相关菌群可能与肠道正常功能和疾病关联度更高。

菌群移植

无菌小鼠灌胃、灌肠等菌群移植的方式是最常采用的菌群移植方法。

测序选择

16S测序：只能进行物种水平的研究，该方法操作简单、价格便宜；在不明确某一疾病和肠道菌群的关系时，可以先通过16S测序进行初步筛选，为后续更深入的研究提供依据。

宏基因组测序：可获得肠道细菌、真菌、病毒等物种的包括基因、物种和功能信息，该方法广泛应用于肠道菌群数据挖掘以及肠道菌群相关疾病发生机制或药物作用机制的研究等，较为昂贵，可能只覆盖到更复杂生命集合体中很浅的一部分。

3、案例

◆ 2-3分科研思路（测序及分析）

背景：囊性纤维化直接影响肺和胃肠道等的功能，胃肠道的囊性纤维化跨膜电导调节功能障碍的表现以及频繁使用抗生素的过程都将破坏肠道菌群。

方法：选取43位病人，粪便中提取基因组DNA进行焦磷酸测序，利用PCR技术对16S rRNA进行扩增，扩增产物利用Roche 454 GS FLX进行测序，用QIIME对原始序列进行修剪，并与SILVA 16S rRNA数据库进行比对，通过系统发育分析（OTU），对微生物多样性和不同微生物的丰度进行分析。PCoA主坐标分析观察个体或群体间差异。

Burke DG, Fouhy F, Harrison MJ, et al. The altered gut microbiota in adults with cystic fibrosis. BMC Microbiol. 2017; 17(1):58. IF=2.58

◆ 5分科研思路（测序+简单验证）

研究表明肠道与1型糖尿病（T1D）密切相关，研究采用16s测序的方法分析54名（19位诊断为T1D的患者但十二指肠黏膜正常，19位活检时诊断为腹腔疾病的患者，16位健康人群）接受胃十二指肠内窥镜检查和活检的患者肠道微生物组成，PCR及免疫组化检测活检组织炎症相关指标达标变化，研究发现T1D中的十二指肠粘膜呈现疾病特异性炎症特征和微生物群异常有关。

通过91个与炎症相关基因的表达（细胞因子、趋化因子和趋化因子受体等），得出T1D患者的肠黏膜具有明显不同的炎症反应

焦磷酸测序结果显示，T1D患者中变形菌门减少，厚壁菌门增加

Pellegrini S, Sordi V, Bolla AM, et al. Duodenal mucosa of patients with type 1 diabetes shows distinctive inflammatory profile and microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2017; 102(5):1468-1477. IF=5.5

◆ 10分科研思路（药物干预+大样本测序+实验验证）

人群选择：187例2型糖尿病(T2D)患者

药物治疗：葛根芩连汤（高、中、低剂量：44, 52, 50人）及安慰剂（41人）

检测时间点：0week ，4week，8week，12week

研究内容：

1）鉴定和药物治疗相关的maker，并与临床指标关联；

2）药物干预不同阶段的肠道菌群研究，分析肠道菌群改变与症状缓解出现的因果关系；

3）q-PCR进行结果验证，验证特定菌株与药物治疗及临床指标的关联

Xu J, Lian F, Zhao L, et al. Structural modulation of gut microbiota during alleviation of type 2 diabetes with a Chinese herbal formula. ISME J. 2015; 9(3):552-562.  IF=9.52.

◆ 高分文章思路

1）多组学结合研究

北大姜长涛等人2018年11月5日在《Nature Medicine》上发表题目为《Gut microbiota and intestinal FXR mediate the clinical benefits of metformin》的文章。该研究对诊断为2型糖尿病（T2D）患者的样本进行了宏基因组和代谢组学分析，并通过一系列的实验验证，表明二甲.双胍可通过肠道微生物群来改善代谢功能障碍，并通过脆弱拟杆菌-GUDCA-肠FXR轴进行。
文章设计思路如下：

引文：Sun L, Xie C, Wang G, et al. Gut microbiota and intestinal FXR mediate the clinical benefits of metformin. Nat Med. 2018; 24(12):1919-1929. IF=32.621

2）疾病相关maker机制研究

作者基于宏基因组测序，在来自患有结肠直肠癌（CRC）的患者（255例）的粪便样品发现比没有CRC的个体的粪便更高的消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）丰度。进而研究了P anaerobius是否有助于小鼠结肠肿瘤的形成及其可能的致癌机制。

技术路线：

Tsoi H, Chu ESH, Zhang X, et al. Peptostreptococcus anaerobius Induces Intracellular Cholesterol Biosynthesis in Colon Cells to Induce Proliferation and Causes Dysplasia in Mice. Gastroenterology. 2017; 152(6):1419-1433.e5. IF=20.773

3）菌群移植类

德克萨斯大学MD安德森癌症中心Yinghong Wang等人于2018年11月12日在《Nature Medicine》上发表题目为《Fecal microbiota transplantation for refractory immune checkpoint inhibitor-associated colitis》。该研究报道了粪菌移植（FMT）成功治疗难治性免疫检查点抑制剂（ICI）相关结肠炎的案例，这些病例提供了具有挑战性的和新颖的证据，即通过FMT调节肠道微生物组可以与难治性ICI相关性结肠炎的显著和快速改善相关联，并对潜在机制进行早期见解。

 

    Wang Y 1, Wiesnoski DH 2, Helmink BA，et al. Fecal microbiota transplantation for refractory immune checkpoint inhibitor-associated colitis. Nat Med. 2018; 24(12): 1804-1808. IF=32.621
 

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