利用“无创”技术检测活细胞中荧光蛋白表达

简介 

在过去的五年中，荧光蛋白在监测体内生 物学研究中，起到越来越重要的作用。源 于维多利亚多管发光水母中的绿色荧光蛋 白(GFP)是最早被我们应用的荧光蛋白， 但是随着时间的推移，现在我们可以使用 的荧光蛋白种类也越加丰富，包括加强型 的变异GFP蛋白、从其他种类水母中发现 的荧光蛋白和珊瑚礁蛋白。它们都可以在 众多的细胞和组织中被克隆复制，从细菌 到酵母，从植物到哺乳动物。这些荧光蛋 白稳定、细胞毒性小、而且不需要额外的 辅助也能在体内产生可见的荧光。因此， 它们可以被用作分子靶标或者独立的报告 因子去视化、追踪和定量多种不同的细胞 进程，包括细胞合成与代谢，蛋白转运， 基因诱导和细胞谱系。不同的荧光蛋白具 有不同的颜色，因此也可被用于多重检 测。这些荧光蛋白都能被荧光显微镜和流 式细胞仪检测到。但是相应的，如果我们 不做细胞分选或监测细胞内迁移，具有荧 光功能的微孔板读板机将是一个更好、更 方便和更高通量的选择。下面，我们将会 向大家展示Molecular Devices微孔板读板 机如何利用“无创”技术检测活细胞荧光 蛋白。我们将从Clontech公司获得的三株 HEK-293细胞系进行不同荧光蛋白的稳定 转染。这次研究的目的：1）优化三株细 胞系的波长设置，2）通过稀释细胞系来 确定检测下限LLD，3）证明在一种细胞系 中识别另一种细胞系的可行性。 

材料 

• HEK-293细胞系稳定表达三种荧光蛋 白：

• AcGFP-多管发光水母中产生的另一 种GFP(但不同于维多利亚水母) 

• ZsGreen-与GFP相似，但更(来自珊 瑚礁) 

• DsRed-一种来自珊瑚礁的红色荧光 蛋白 

• 非转染的HEK-293细胞系，作为对照 

• DME: High Glucose (Irvine Scientific cat. #9024)  

• G418: Geneticin (Gibco cat. #11811-031)  

• FBS (Irvine Scientific cat. #3000A)  

• Glutamine/Pen/Strep Solution (Gibco cat. #10378-016) 

 • Trypsin/EDTA 1X in HBSS (Irvine Scientific cat. #9341)  

• 10X Hank’s Balanced Salt Solution  (Gibco cat. #14065-056)  

• 1M HEPES (Irvine Scientific cat. #9319)  

• HBSS Buffer (1X Hank’s Balanced  Salt Solution with 20 mM HEPES  buffer): Made from 10X Hank’s  Balanced Salt Solution (100 mL), 1M  HEPES (20 mL) and water for cell  culture (880 mL) 

 • 细胞培养用水 (Irvine Scientific cat. #9312)  

• 黑色透明平底96孔板 (Corning cat. #3603)或黑色透明平底 384孔板（Corning cat. #3712）