高效微生物筛选技术引领抗体发现新时代

发布时间： 2023-12-08 17:04:14 来源：美谷分子仪器

背景

过去几十年中，单抗治疗在癌症，自身免疫病等疾病中得到广泛应用。随着科学进步，抗体的发现和分离手段也不断更新，包括杂交瘤技术，转基因动物，重组 DNA 技术，B 细胞分离技术以及噬菌体展示技术等。尽管最先出现的杂交瘤技术曾是抗体发现中的半壁江山，噬菌体展示技术仍然凭借着高通量，简便，快速的特点在激烈竞争中脱颖而出，成为当前抗体发现非常的重要手段。

噬菌体展示是一种用于研究蛋白质-蛋白质，蛋白质-多肽，蛋白质-DNA 相互作用的技术。利用基因工程的方法将编码目的蛋白或者多肽的 DNA 与编码噬菌体外壳蛋白的 DNA 融合，最终将目标蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，然后使用亲和选择的方法选择展示目标蛋白或多肽的噬菌体，通过测序得到目标序列后在进行下游的基因工程改造。其最大的优势在于将抗体的基因型和表型联系起来，快速、低成本、高通量地进行抗原筛选。

噬菌体展示技术由乔治·P·史密斯在 1985 年首次创建，并且凭借此在 2018 年获得了诺贝尔化学奖。1990 年 Mc Cafferty 利用噬菌体展示技术生产重组蛋白^[1]，之后该技术在全世界范围内得到广泛应用，其中最成功的应用是进行抗体展示。第一个获得 FDA 批准的 PD-L1 抗体 Atezolizumab 就是通过噬菌体展示技术筛选得到的。目前用于抗体发现技术的主要是丝状噬菌体 M13，它能够将单链 DNA 包装成病毒颗粒，在不引起细胞裂解的情况下感染细菌，该特性允许研究人员使用噬菌体 M13 在病毒表面显示外源肽或蛋白质，使其适应各种应用，例如抗体生产，药物筛选和疫苗开发。

实验步骤

噬菌体展示的实验流程包括噬菌体展示库构建，噬菌体淘选，噬菌体感染和扩增，噬菌体挑选，产物分析确定候选噬菌体，以及 DNA 测序等步骤（图1）。

图 1, 噬菌体展示工作流程概览

目前在抗体开发领域主要包括三种噬菌体展示抗体库，包括来自感染患者或者免疫动物 PBMC 的免疫库，来自未免疫者 PBMC 的天然库，以及随机来源于抗体链 CDR 区的合成库^[2]。淘选过程通过固定或标记抗原方法来筛选和富集与抗原特异性结合的噬菌体抗体。将目标抗原固定在微板孔或偶联到磁珠上，随后加入噬菌体抗体文库，使其与抗原进行特异性结合^[3]。在经过 3-5 轮淘选后，非特异和亲和力低的噬菌体被洗涤掉，只保留高亲和力的噬菌体，几轮的重复筛选使得在数十亿个不同的文库中富集到表达特异性抗体的噬菌体。将与目标抗原结合的噬菌体洗脱下来，随后将这些高亲和力的噬菌体感染大肠杆菌，琼脂板铺板培养并挑选出噬菌体^[4]。最后，对候选克隆的表达产物进行检测来确定抗原特异性的抗体，得到的抗体通过测序确定基因序列，用于下游的基因工程，例如亲和力改善等。

QPix 在噬菌体

展示实验中的应用

在这个实验流程中，QPix 系统可用于噬菌体/噬菌斑挑选、高通量点样、文库重排和文库复制等步骤（图 2）。同时系统可完整记录这些操作，包括源板（source plate）和终板（destination plate）的信息，便于数据追溯和检索。QPix 系统还可以实现自动化地加样和涂布，减少手工操作，提高整体效率以及成功率。

图 2, 典型的 QPix 工作流程以及在噬菌体展示技术中的应用

01 挑选噬菌体 <<<<

淘选后一般可获得数千个噬菌体，手工挑选工作量巨大且容易出错（表 1），QPix 系统具有高达 3000 个克隆/小时的挑取速度，可以轻松满足通量的要求。

表 1：QPix 系统挑选和手工挑选的比较

	QPix 挑选	手工挑选
筛选标准	软件客观分析	主观判断
挑取时间（5000个克隆）	<2 小时	1周
准确性	>98%	低

配套的分析软件可以利用克隆的大小、圆度、轴比以及克隆间距进行筛选，从而更加准确高效地获取噬菌体克隆（图 3）。QPix 配套专用于大肠杆菌/噬菌粒、噬菌斑的挑针（图 4），保证微生物样品挑取和转移的效率。QPix 系统整套流程中提供多重措施防止污染。首先整个系统提供封闭环境，实验前可用紫外灯进行灭菌操作，克隆挑取过程中可用三个洗槽对挑针进行依次清洗和灭菌，最后用卤素灯高温灭菌（图 5），防止交叉污染。

图 3, 分析软件筛选出符合要求的噬菌斑，黄色为符合要求的待挑选噬菌斑，红色为不符合要求的噬菌。

图 4, （左图）QPix 配套的挑针，用于大肠杆菌/噬菌粒和噬菌斑的挑取；（右图）噬菌斑挑选后成像，较亮的小孔为挑针留下的痕迹

图 5, QPix 系统克隆挑取过程

02 通量点样 <<<<

在分析筛选环节，QPix 的点样功能可以制备高密度芯片，实现高通量的分析。点样功能将液体样品点到尼龙膜或NC膜上，后续可开展点杂交实验（图 6）。一张 22 cm × 22 cm 的膜上最高可以点 57600 个样品。在噬菌体展示实验中，按一张膜 3000 个样品计算，两张 22 cm × 22 cm 的膜就可以完成 6000 个样品的检测，相比 ELISA 或其他检测方法，点杂交的方法可以节省相当的检测成本以及检测时间，适合初步筛选以过滤大量的阴性样品。

图 6, QPix 的高通量点样功能

03 文库复制和重排 <<<<

QPix 系统支持微孔板复制和重排。通过复制功能可获得多份样品，用于多个检测项目或样品备份（图 7）。重排功能可以将最后筛选到的阳性克隆归集到一起便于样品管理（图 8）。

图 7, 微孔板样品复制

图 8, 微孔板样品重排

04 QPix 涂布功能 <<<<

QPix 系列部分型号具有涂布功能，可以自动吸取菌液并涂布到琼脂板上，减少手工操作及误差，提高效率和成功率。

除了标准型号和功能外，还可以根据需要定制 QPix 系统，从而实现整个实验流程的整合和全自动化。QPix 系统可以整合机械臂、液体处理工作站、培养箱、离心机以及酶标仪等，完成菌液处理、琼脂板涂布、琼脂板培养、克隆挑取、深孔板摇床培养、液体处理及产物检测，实现高通量、全自动化地运行。

展望

噬菌体展示技术从问世到取得诺贝尔奖，成为单抗发现领域当之无愧的“王者”只用了短短几十年，并且基于这一概念也衍生出包括 mRNA 展示和酵母展示等技术，给生物医学领域带来很多的惊喜与收获，这其中离不开其他科学技术的加持，例如基因编辑和测序。而高通量的建库以及筛选流程是未来发展的必然趋势，QPix 系统从加样到涂布，从筛选到挑取，从管理克隆库到制作样品芯片都能实现自动化，代替人工更加客观快速地推动噬菌体展示技术的进展。

参考文献

[1] L Ledsgaard et al., Advances in antibody phage display technology. Drug Discov Today, 2022. 27(8): 2151–2169.

[2] Kumar, R et al., Phage display antibody libraries: A robust approach for generation of recombinant human monoclonal antibodies. Int J Biol Macromol, 135, 907–918.

[3] Ratnikov B et al., High Throughput Substrate Phage Display for Protease Profiling. Methods in Molecular Biology, 2009. 539(539):93-114.

[4] Turunen Let al., Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. Journal of Biomolecular Screening, 2009. 14(14):282-93.

关于美谷分子仪器

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