转膜是把DNA 从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定，是进行各种后续研究（如 RFLP 分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究）的前提。

　　实验目的：

　　掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤

　　实验原理：

　　1．转膜的方式：

　　 向上的毛细管转移

　　 向下的毛细管转移

　　 同时向两张膜转移

　　 电转移

　　 真空转移

　　2．固相支持物的种类及选择：

　　硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA ， < 500 bp 的DNA 无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等）。

　　尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的DNA 结合容量，它能够吸附变性DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有吸附DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把DNA 从凝胶上转到膜上。DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定DNA 。

　　3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择：

　　带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合DNA 是最大优点。

　　硝酸纤维膜：高盐离子强度促进DNA 与膜结合（ 20 × SSC ），低盐离子强度导致小片段DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ，DNA 不能与膜结合。

　　4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs。

　　 取决于毛细管系统，DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。

　　 DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小DNA ，碱转移 2hrs 大部分结合到膜。

　　 DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。

　　实验材料及试剂： 酶消化好的DNA 样品，尼龙膜， 0.2NHCl ， 0.4N NaOH 等。

　　实验步骤：

　　1．0.8% 琼脂糖电泳。

　　 制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（<5mm）及均一性。一般大电泳槽配制 250ml 0.8% 琼脂糖凝胶，采用 42 孔梳子（经济，高效）。

　　 制样，点样：DNA 样品中指示剂量稍多。

　　 电泳：一般 1-1.5V/cm 的电压，使DNA 迁移到适当距离，一般指示剂约移动 10-11cm ( 大电泳槽： 40V × 12-15hrs ，小电泳槽 30V × 4-5 hrs)。

　　2．转膜前的准备：

　　 依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸（ 11 × 12.5 cm ），两张用作盐桥的滤纸，一张与胶同样大小的尼龙膜（ 10 × 10.5cm ），两个玻璃盘、两块有机玻璃板、一根玻璃棒，比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等。

　　3．一玻璃盘中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗净的玻璃板，按图示搭制盐桥 ( 操作示范 ) 。

　　4．凝胶的预处理：

　　a.从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号。

　　b.把凝胶翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盘中，轻轻摇动 10min ，使指示剂变黄色为止（脱嘌呤）。

　　c.倒去 HCl 溶液，加蒸馏水漂洗凝胶。

　　d.倒去蒸馏水，加 0.4N NaOH 中和。

　　e.同时在盐桥滤纸上洒些 0.4 NaOH ，立即将胶放在盐桥上（忌气泡）。

　　5．胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（吸水纸与盐桥相接）。

　　6．在胶面上倒足够量 0.4N NaOH ，小心放置膜（预湿 0.4N NaOH ）使膜覆盖整块胶（要求一次成功，不能移动）。

　　7．膜上放 2 张滤纸，滤纸大小为 15 × 12cm。

　　8．放不少于 5cm 厚的吸水纸，放上玻板，其上压约 500g 的重物，转膜 12 hrs 左右。

　　9．转膜完毕，用 2 × SSC 漂洗膜两次，各 5min 。用 EB 染胶以检测转移效果。

　　10．用两张滤纸包住膜，置于 80-100 ℃的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs 。

　　思考：

　　（1）为什么转膜前要对凝胶预处理？如何处理？

　　（2）怎样提高转移效率？