摘要 随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及其他研究，越来越需要纯度很高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术，本次实验主要是提取啤酒酵母中的蔗糖酶并测定其Km。在试验过程中用乙醇分级沉淀法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛层析提取纯化蔗糖酶。在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词 蔗糖酶 透析 Km
前言
生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理�化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩�干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志，一是要有较高的收率，二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
在分离提纯过程中，应该尽量避免引起蛋白质变性的各种因素，此外，在分离提纯前，必须建立对酶的分析鉴定方法，以正确指导分离提纯地进行。
材料与方法
1 实验仪器
冰箱，低速离心机，电泳仪，722分光光度计，托盘天平，水浴埚，血糖管，透析袋，水平电泳槽，微量加样器，离心管，三角瓶，玻璃棒，滴管，烧杯，移液管，量筒，试管等。
2 实验试剂
乙酸钠，甲苯，蒸馏水，10%乙酸,95%乙醇,0.2%Glc,溶液，3,5二硝基水杨酸试剂。考马斯亮蓝G-250，牛血清白蛋白，2M NaOH,0.1M蔗糖。
3 试验方法
3.1葡萄糖浓度标准曲线的制作：
取11支编号的试管按下表的顺序加入0.2%Glc，水及3,5-二硝基水杨酸试剂。然后在沸水浴中加热5分钟，然后立即用自来水冷却，转移至血糖管中并用蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm测光密度，结果如下表所示：
管号        含糖量（ug）
BG浓度        0.2%Glc
标准液（ml）        水（ml）        3，5-二硝基
水杨酸试剂（ml）        OD540nm
1        0.0        0.0        2.0        1.5        0.0
2        0.4        0.2        1.8        1.5        0.062
3        0.8        0.4        1.6        1.5        0.137
4        1.2        0.6        1.4        1.5        0.223
5        1.6        0.8        1.2        1.5        0.300
6        2.0        1.0        1.0        1.5        0.385
7        2.4        1.2        0.8        1.5        0.468
8        2.8        1.4        0.6        1.5        0.509
9        3.2        1.6        0.4        1.5        0.597
10        3.6        1.8        0.2        1.5        0.675
11        4.0        2.0        0.0        1.5        0.753
3.2标准蛋白曲线的制作
取11支编号的试管，分别准确加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分别加入1.5ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，摇匀，放置3min后，在595nm比色读取OD值，结果如下表所示：
管号        标注蛋白浓度（ug/ml）        牛血清蛋白标
准液（ml）        水（ml）        考马斯亮蓝G-250
蛋白染色试剂（ml）        OD595
0        0        0        1.0        1.5        0
1        20        0.1        0.9        1.5        0.025
2        40        0.2        0.8        1.5        0.066
3        60        0.3        0.7        1.5        0.243
4        80        0.4        0.6        1.5        0.368
5        100        0.5        0.5        1.5        0.468
6        120        0.6        0.4        1.5        0.530
7        140        0.7        0.3        1.5        0.650
8        160        0.8        0.2        1.5        0.699
9        180        0.9        0.1        1.5        0.823
10        200        1.0        0.0        1.5        0.947
3.3转化酶的纯化
3.3.1粗品的制备和乙醇分级沉淀
3.3.1.1自溶
用台秤称取40g的新鲜啤酒酵母放在250毫升三角瓶中，再分别放入1.2克乙酸钠细粉末、20毫升甲苯。然后在35℃水浴中间隔片刻震荡、保温30分钟，此时会观察到菌体自溶现象。
3.3.3.2抽提及粗酶的制备
往上述自溶液中加入60毫升水，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4000RPM*15min离心。取出离心管后分三层：下层透明，中间为蛋白层，上层为有机层。用吸液管将最上层的甲苯吸去，然后可再用一药勺挡住块状粘稠物，倾斜离心管倒出上清液。弃去粘稠物。此时会有一些悬浮物存在。再离心一次（4000RPM*20min），如上清液已滤清，小心倒入250毫升烧杯中。得到的溶液就是无细胞抽提液即粗酶液。
量出粗酶液的体积VE1=42ml，从中取出1毫升置0―4℃保存，将待测酶活力和蛋白浓度。
3.3.3.3乙醇分级沉淀
先用10%的乙酸调粗酶液pH在4.4―4.6之间，记录加入10%乙酸的体积。
⑴ 32%乙醇饱和度
按下列的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达到32%时所需乙醇体积。
X1/V+X1=0.32
其中V=44ml，需要加入95%的乙醇体积：X/0.95=22ml
注意：在滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线 。
滴加结束后，于4000RPM*5min。上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。
⑵47.5%的乙醇饱和度
按下式算出使酶液乙醇浓度达到47.5%时所需乙醇的量。
X2/V=X2=0.475
需要加入95%的乙醇体积X2/0.95=44ml
按下式算出使酶液乙醇浓度达到47.5%所需补加的乙醇的体积。
X2/0.95-X1/0.95=22ml
然后静置10min，于4000RPM*10min，弃去上清会得少量沉淀。将沉淀用10ml，pH6.0，0.005MPBS溶解（10mlPBS应分2-3次充分溶解），装入自制的透析袋中，并作一标记，将透析袋放入盛有pH6.0，0.005MPBS的烧杯中进行透析，时间为2-3小时（中间要换一次透析液，并置冰箱中进行透析）。透析后将透析酶液离心，4000RPM*5min，取上清，量体积即为E2并留1ml（0-4℃保存）待测酶活力及蛋白浓度，其余酶液上DEAE-Cellulose柱。
3.3.2第一次纯化
3.3.2.1装柱
本实验使用的层析柱的规格是1.5cm（内径）*20cm（高）。把柱子垂直固定好。将DEAE-Cellulose装柱，床高距柱顶2cm为宜。用起始缓冲液（pH6.0,0.005M PBS），平衡流速成4ml/5min。
3.4.2.2柱的平衡
装好柱后，用起始缓冲液（pH6.0,0.005M PBS），平衡流速成4ml/5min。目的是交换剂上的平衡离子全部变成起始缓冲液的相应离子。另一方面，在流洗柱的过程中，也可以使交换剂床紧密，从而提高分离效果。平衡洗柱的流出体积至少应是床体积的5倍左右。
3.3.2.3上样
将柱中多余液体放出后，将2ml样品小心加到层析柱中，打开流速夹，使样品液流入柱内。然后加pH6.0,0.005M PBS150ml洗柱。此流出液理论上应不含我们所需要的酶，因此可不必收集，但必须检查是否有酶活力存在。
3.3.2.4洗脱
待150ml PBS洗完后，改换含0.1M NaCl的pH6.0,0.005M PBS洗脱（此处洗下来的是我们所需的酶），流速为0.6-0.8ml/min，每管收集5ml，收集5-7管后，改换含0.2 M NaCl的pH6.0,0.005M PBS洗脱，收集至经检查无酶活力为止。
3.3.2.5酶活力的检测
取试管若干支，编号，各加入2ml5%蔗糖（pH4.6）每间隔一管取0.05ml收集液，按先后顺序分别加入上述含2ml5%蔗糖的试管中混匀，置35℃水浴10min仍以先后顺序加入0.5ml 1M NaOH,立即摇匀，加入1.5ml3，5―二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，转移至血糖管中，用蒸馏水稀释至25ml，塞好，摇匀。直接目测，即可确定活力高峰范围。合并活力高峰酶液，量体积，即得E3，从中取出1毫升置0―4℃保存，将待测酶活力和蛋白浓度。将其余的酶液装入透析袋中，作一标记用pH6.0,0.005M PBS透析3小时（置冰箱），然后用聚乙二醇6000(PEG)将酶液浓缩至1―1.5ml，供下步用。
3.3.3第二次纯化：分子筛层析
3.3.3.1装柱
取已经与处理好的G-150适量，装入自制的1*25cm的层析柱中，用pH6.0,0.005M PBS平衡，流速1ml/5min,流出液体积大约为柱床体积5倍左右视为平衡好。
3.5.2上样
与一般柱层析相同，将柱中多余液体放出后，将样品小心加到凝胶柱上，打开流速夹，使样品流入柱内。然后加pH6.0,0.005M PBS150ml洗脱，检测酶活力，确定活力高峰位置，收集活力高峰范围内的酶液，量体积，即为E4。留1ml于4℃保存作为 测定蛋白质浓度和酶活力用。其余用于电泳法检测酶纯度和测定米氏常数Km用。
3.4转化酶活力及蛋白质浓度的测定
1活力测定
酶液稀释：将E1�E2�E3�E4依次稀释40�160�400�400倍；
2反应：取4支试管分别加入2ml稀释的酶液（每个样品平行作3份），一个空白对照加0.5 ml1 M NaOH，摇匀，使酶失活；另3支为测定管。再分别加入2ml5%的蔗糖，并准确计时10min，分别加入0.5 ml1 M NaOH，摇匀，终止反应。从反映混合液中取出0.5 ml于血糖管中，加1.5ml3，5―二硝基水杨酸和1.5ml蒸馏水，混匀，于沸水浴中加热5 min，定容至25ml摇匀，在540nm下测定吸光度。
3.5蔗糖酶米氏常数―Km的测定
3.5.1取11支试管，编号，按下表将蔗糖液，乙酸缓冲液分别加入各管中；
3.5.2于各管依次间隔2min加入酶液2ml，记时，立即摇匀，于室温下静置10min；
3.5.3按同样顺序和时间间隔加入0.5 ml1 M NaOH，摇匀终止反应；
3.5.4吸取反应液0.5ml，加入已含有3,5-二硝基水杨酸和1.5ml蒸馏水的试管中摇匀，于沸水浴加热5min，冷却后于血糖管中定容至25ml，摇匀，在540nm测定值OD。Km的测定：


管号        0.1M蔗糖(ml)        乙酸缓冲液(ml)        酶液(ml)        2M NaOH(ml)        吸取反应液(ml)        3，5-二硝基水杨酸 (ml)        蒸馏水(ml)        [S]        1/[S]
(1/M)        1/V
(1/OD)
1        0        2.00        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0                0
2        0.20        1.80        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.005        200        5.464
3        0.25        1.75        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.000625        160        4.367
4        0.30        1.70        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0075        133.8        3.571
5        0.35        1.65        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.00875        114.8        3.247
6        0.40        1.60        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5                100        2.701
7        0.50        1.50        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0125        80        2.222
8        0.60        1.40        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.015        66.7        1.992
9        0.80        1.20        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.02        50        1.484
10        1.00        1.00        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.025        40        1.238
11        1.50        0.50        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0375        26.7        1.045

结果与分析
4.1根据图表的数据可以得到下面的曲线，根据本曲线为后面酶活力的测定提供参考。得到公式y=0.1895x-0.0054

4.2根据得到的蛋白曲线得到如下公式：y=0.0049x-0.0529

4.4在540nm下测定吸光度结果如下:
酶        OD540        平均值
E1*40        0.623        0.679        0.720        0.674
E2*160        0.528                        0.528
E3*400        0.269        0.518（舍掉）        0.271        0.270
E4*400        0.293        0.234        0.299        0.275
在测定的时候，由于E2的量不足，因此没能完成3组的测定，由于数据比较单调，因此对实验结果的可靠性比较低；测定E3时，第二组数据与另外两个出入很明显，可能是操作中酶液量取不准确或者试管洗刷不彻底，因此舍弃这个数据。
在595nm的吸光度结果如下
酶        OD595
E*40        0.522
E*40        0.240
E*4        0.380
E*5        0.135

跟去上图得到公式:y=0.0258+0.0229
横轴截距=-1/Km
得到Km=0.1127，而Km的理论值是25~28mM，所得结果明显大于理论值，估计主要原因可能是提取过程中由于没有严格在低温下操作和在离心时由于多个小组连续使用离心机，使得离心机的温度升高等多种原因，导致酶活降低。
4.5数据处理与分析
步骤        样品总体积(ml)        酶活力(u/ml)        总活力(u)        蛋白质浓度(mg/ml)        总蛋白质量(mg)        比活力(u/mgPr)        提纯倍数(fold)        阶段收率(%)        总收率(%)
E1        42        358.5        15057        4410        185220        0.08129        1        100        100
E2        7.5        1126        8445        2400        18000        0.4692        10        56        56
E3        5        1452        7260        352        1760        4.125        105        86        48
E4        1.7        1482.5        2520        143        242        10.36        765        35        17
我们经过多步操作提取到了达到较高纯度的蔗糖酶。由于实验步骤较复杂，且不是连续操作，而是中间有很多间断等多种因素的影响，以致所得数据不太理想。由于本实验的衔接性比较强，随着实验的深入，试验的偏差就愈来愈明显，因而后面数据较难取舍，只能得出十分粗糙的结论，因而可信度也随之降低。其中E1，E2是试验的初始步骤，相对可信度比较高；另外尽管E3，E4蛋白浓度差别比较大，但酶活力基本相同，酶活力没有上升，没有达到预期的目的。酶的总收率达17%，基本达到预期目的。另外，由于时间仓促和操作水平的限制，本实验也有许多不足之处需要改进。