结晶紫法活性测定 1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×105个/ml。接种于96孔细胞培养 板，100µl/孔。接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。 2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D，使终浓度为1.5µg/ml，配成样品稀释液。取此稀释液900µl至eppendorf 管中，另在9个5ml管中加入700µl稀释液。 3、用完全培养基将基因工程 人肿瘤凋亡素样品（上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支）复溶至1000µl（液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操作），取出100µl至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。再从此管中吸出100µl至下一管中，如此反复n次（即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时）。 4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中，充分混匀。再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl稀释液的5ml管中，如此反复9次（即测定时倍比稀释样品）。 5、弃去96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6)；从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。第1排中不含细胞，加入100µl/孔含有放线菌素D的稀释液作空白对照；第11排加100µl/孔稀释液作细胞对照；第12排加不含放线菌素D的RPMI-1640完全培养基。 6、将加好样品的96孔板置37℃、5%的CO2培养箱中继续培养22h，显微镜下观察细胞形态变化，初步判断结果。 7、弃除培养板中的培养基，每孔加入100µl染色液（1.5mmol/L结晶紫）染色30min。洗去染色液，甩去水分并在吸水纸上拍打以使干燥。冲洗程度以在吸水纸上拍打时，没有颜色出现为宜。 8、充分干燥后，每孔加入100µl33%浓度的冰醋酸，在振荡仪上充分振荡使结晶溶解。设定λ=595nm酶联检测仪测定各孔的吸光值，据此数据进行统计学处理，计算出对细胞50%杀伤时所需的基因工程人肿瘤凋亡素的浓度。