1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。

　　2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循环次数少，一般为12个循环。

　　反应体系：

　　10x pyrobest Buffer 5 ul

　　dNTP Mixture(10mM) 1ul

　　模板DNA(5~50ng) 1ul

　　primer 1 (125ng) 1ul

　　primer 2 (125ng) 1ul

　　pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul

　　加无菌蒸馏水至 50ul

　　3、产物沉淀纯化：加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C冰箱）5min,离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）

　　4、DpnI酶切：Buffer 2ul

　　BSA（100╳） 0.2ul

　　DNA x ul

　　DpnI 0.5ul

　　加无菌去离子水至 20ul

　　30゜C酶切 1~4 h ；65゜C 水浴15min 终止反应。

　　5、将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

　　6、测序验证