【求助】悬浮细胞的免疫组化

参与者：joveandjuno

各位前辈，我想做悬浮细胞的免疫组化，看帖子说应该滴片，滴完片子怎么做组化呢？ 用不用固定什么的？ 我想要看的抗原在细胞膜上。还有，贴壁细胞做免疫组化的话，观察细胞膜上的抗原，应该用什么固定？

谢谢～

参与者：laugh

用多聚赖氨酸包被片子来滴片，滴片后离心，去除多余液体，一般用甲醛或多聚甲醛固定，也可以视情况用其他固定剂如冷的丙酮或乙醇。

参与者：popestudy

首先贴壁细胞的制备比较简单，可以使其生长在适当的栽玻片或盖玻片打夯。如果实验的分辨率要求不高或者是大量样品的筛选，可使细胞生长在塑料组织培养皿中。在处理悬浮的细胞时一个简单的方法是在固定细胞前将细胞黏附在固相支持物上。可以使用甩片机。

此时1、首先用PBS洗涤细胞（400r/m，离心5min。）重悬于PBS中并调整细胞浓度。2、将玻片固定与甩片机的转头上，然后加入0.1-0.5ml的细胞悬液.3、迅速使离心力达到1200r/m，离心5—10分钟。4、使玻片上单层细胞在空气中干燥15—20min。然后就可以固定细胞了。悬浮细胞可以用多聚甲醛固定。

参与者：joveandjuno

谢谢～我明天就去试试～

参与者：SH2UA

楼主想要看的抗原在细胞膜上，可以在悬浮状态下染色。只不过细胞在悬浮状态下，洗涤过程复杂，应注意离心时间不要过长或转速太高。

可以用4%多聚甲醛固定悬浮细胞，要临用前配置多聚甲醛。

固定可参考以下步骤：

1 用PBS洗涤细胞2次，200G离心5MIN 。2 用多聚甲醛重悬细胞，室温下静置15MIN，间或摇动。3 200G离心5MIN ，用PBS重悬细胞，重复洗涤细胞2次。此时的标本可用于后续的抗体检测。

悬浮细胞如果是进行细胞内部抗原的定位，可用甩片机甩在一张载玻片上，正如popestudy讲的。如果没有甩片机，可以先用带电的交联剂涂在盖玻片上，然后再将细胞粘附于盖玻片上。常用的有多聚赖氨酸。以后的操作与贴壁细胞相同。当然，检测细胞表面抗原也可以参考此方法。

贴壁细胞的固定可以用多聚甲醛、乙醇、丙酮、甲醇等，不过要注意高浓度的丙酮会使塑料溶解。