1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教

参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.

在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：

1，上样时没有目的蛋白，可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了；

2，目的蛋白结合在FPLC柱子上没被洗脱；

3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰；

4，电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.

FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看与基线相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。

2、问：我现在做的是裂殖酵母表达，表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法，但我转化了好几次都没有结果，是否也可以用电转化，在多克隆位点把质粒线性化？

参考见解：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。

化学转化法对酵母转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了

由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的

至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。

3、问：我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?

参考见解：对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒（比如９K等）的菌作为对照，诱导过程中同样加入甲醇，诱导的时间均一样，每次样品都会有一个对照。

阳性对照可以用以前表达的比较稳定的蛋白的工程菌充当。

4、问：请教各位高人：我用G418筛转化有多拷贝的细胞株,筛了两次,四个梯度0.5mg/ml,1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml.结果都没长出细胞，空载体对照也没长出。载体是pPIC9K。我用电转，涂于MD固体培养基，发现转化效率较低，每块板长出十几个点，是否是转化效率低导致的？谢谢指教！

参考见解：不知道你的转化条件是否得到优化？我认为您是否可以从以下几点入手：

（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；取100~500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5。

（2）电击后马上加入1ml冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体混匀。

（3）推荐：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4~10msec。