用荧光激活的细胞分类仪检测调亡细胞

1 ）原位缺口翻译检测裂解的 DNA 片段

1． 取 106 经促调亡物质处理的细胞，用 1 ％ BSA-PBS 洗涤细胞后加入 0.1ml FITC 标记的抗 CD4 或抗 CD8 单克隆抗体， 4 ℃ 20 分钟。用 1 ％ BSA-PBS 洗涤细胞。置冰上。

2． 加入 0.1ml 1 ％多聚甲醛，置冰上 5 分钟，加入 60 ％（ v/v ）甲醇溶液，轻轻悬浮细胞， 4 ℃固定细胞 15 分钟。 4 ℃离心 500 × g 10 分钟，去上清液。

3． 加入 0.1ml 0.1 ％ Triton X-100 ， 4 ℃ 15 分钟。用 1 ％ BSA-PBS 洗涤细胞 2 次。加入 50 μ l 缺口翻译缓冲液（ 50mmol/L Tris-HCl pH7.4 ， 5mmol/L MgCl2 , 1.5U 大肠杆菌 DNA 多聚酶 I ， 50nmol/L 生物素 -14-dUTP ， 50nmol/L dATP, 50nmol/L dGTP, 50nmol/L dCTP ）， 37 ℃反应 60 分钟。用冷 PBS 洗涤细胞 2 次，悬浮于 0.1ml 预冷的 1 ％ BSA-PBS 中。

4． 加入 10 μ l 抗生素蛋白 -PE ， 4 ℃ 30 分钟，用冷 PBS 洗涤细胞。

5． 上样于 FACS 仪，用 FACScan Lysis Ⅱ软件分析。可以同时了解调亡细胞的类型。

2 ）末端脱氧核苷酸转移酶检测法检测裂解的 DNA 片段

1． 在 37 ℃，含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液中，用促调亡物质喜树碱处理人 PBMC 4 小时。或用 10 － 5 g/ml 地塞米松处理小鼠胸腺细胞 4 小时。

2． 取 106 经处理的细胞，用 1 ％ BSA-PBS 洗涤细胞后加入 0.1ml FITC 标记的抗 CD 或抗 CD8 单克隆抗体， 4 ℃ 20 分钟。用冷 1 ％ BSA-PBS 洗涤细胞 2 次。置冰上，加入 0.1ml 1 ％多聚甲醛， 4 ℃ 15 分钟。用冷 PBS 洗涤细胞 2 次，加入冷 70 ％（ v/v ）乙醇溶液，轻轻悬浮细胞，－ 20 ℃固定细胞 24 小时。 4 ℃离心 500 × g 10 分钟，去上清液。

3． 用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入 50 μ l TdT 反应液悬浮细胞， 37 ℃反应 30 分钟。用 PBS 洗涤细胞 2 次，悬浮于 0.1ml PBS 中。

4． 加入 10 μ l 抗生物素蛋白 -TC 或抗生物素蛋白 -FITC ，室温反应 30 分钟，用 PBS 洗涤细胞。

5． 上样于 FACS 仪，分析调亡细胞的类型和调亡情况。

3 ） 7-AAD 染色法

1． 取 5 × 105 经不同处理的细胞，用 PBS 洗涤细胞 1 次，加入 10 倍量 PBS ，离心 500 × g 5 分钟，去上清液。

2． 用 0.5ml 含 20 μ g/ml 7-ADD 的 PBS 悬浮细胞， 4 ℃避光放置 20 分钟。

3． 直接在 FACS 上用 650nm 滤光片检测红色荧光，用 Lysis Ⅱ软件分析，可区分活细胞（ R1 ）、早期调亡的细胞（ R2 ）和后期调亡细胞 / 死细胞（ R3 ）。

4 ） PI 染色法

1． 取 2.5 × 105 ～ 3.5 × 105 经不同处理的细胞，接种在 24 孔细胞培养板的各孔中，在 37 ℃ 5 ％ CO2 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 24 ～ 48 小时。

2． 每孔加 50ml 100mg/ml PI 。直接在 FACS 上用 FL2 滤光片检测红色荧光，用 Lysis Ⅱ软件分析，可区分活细胞（ R1 ，不着染）和死细胞（ R2 ，着染）。

5 ） Annexin V 、 7-AAD （或 PI ）联合染色法

1． 配制 10 倍浓缩的结合缓冲液：含 140mmol/L NaCl, 25mmol/L CaCl2 的 0.1mol/L pH 7.0 Hepes/NaOH 缓冲液， 4 ℃保存，用前用双蒸水稀释 10 倍。

2． 用预冷的 PBS 洗涤经不同处理的待测细胞，洗 2 次。用结合缓冲液将细胞配制 1 × 106 /ml 。取 0.1ml 细胞悬液置 5ml 培养管中。

3． 加入 5 μ l AV-FITC ，再加 5 μ l 7-ADD 或 10 μ l PI 。稍稍混悬细胞，置暗处，室温（ 20 ～ 25 ℃） 15 分钟。

4． 立即加入 0.4ml 结合缓冲液，终止反应。立即在 FACS 上分析。注意设立对照：未经处理的细胞对照，排除自发调亡；不加染色剂的对照；只加 AV 的对照；只加 7-ADD 或 PI 的对照等。

6 ）溴乙啶 / 吖啶橙染色法

1． 用细胞培养液将经不同处理的细胞配成 5 × 106 /ml 。向 25 μ l 细胞悬液中加 1 μ l 溴乙啶 / 吖啶橙染液。室温中染色适当时间。

2． 在荧光显微镜的高倍镜下计数活细胞和有异常染色质分布的细胞。吖啶橙着染经理调亡的细胞核，溴乙啶染色死亡的细胞，活细胞不被染色。