单细胞 CMC 试验

1． 用细胞培养液等量混合效应细胞和靶细胞， 30 ℃水浴 10 分钟。室温中 250 × g 离心 5 分钟，去上清液。同量靶细胞不加效应细胞同样处理作为对照。

2． 用少量细胞培养液轻轻悬浮细胞，吸管上下吹打 5 ～ 6 次。这一分散细胞的步骤关系到试验的准确性和重复性，应当设法保持技术的一致性。取少许细胞悬液，稀释后直接在显微镜下计数效应细胞和靶细胞的结合率，即平均每 100 各淋巴细胞中结合了靶细胞的效应细胞的数目。

3． 其余的细胞悬液与等量液态（ 37 ℃）的 0.5 ％低熔点琼脂糖混合均匀，铺在培养皿中，厚度≤ 2mm 。固化后小心加入适量细胞培养液覆盖琼脂糖层，置 37 ℃ 5 ％ CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 1 ～ 4 小时。

4． 吸去培养液，加入适量 0.1 ％台盼蓝覆盖琼脂糖层，室温染色 5 分钟。吸去染色液，加入适量 0.2 ％甲醛覆盖琼脂糖层，室温固定 5 分钟。

5． 在显微镜下死亡细胞呈蓝色，计数靶细胞的死亡率。靶细胞的自发死亡率可以从经同样处理的靶细胞对照培养皿中测得。如区分效应细胞和靶细胞有困难，可以用双醋酸荧光素染色加以区分。镜下计数。