细胞介导的细胞毒作用(CMC)检测法
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1)用淋巴细胞分离液分离PBMC 1.抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中,加2倍量磷酸盐(PBS )悬浮细胞。将此悬液小心加在淋巴细胞分离液上,400×g离心30分钟。 2.离心后红细胞在管底,PBMC在血浆和淋巴细胞分离液的交界面。收集PBMC,用PBS 洗涤细胞两次,每次离心150×g 10分钟。低速离心可以减少血小板沉淀,但细胞沉淀物较松散,去上清液时注意丢弃细胞。 3.将细胞悬浮于含2%~5%人AB血清的RPMI-1640 培养液中,计数细胞,用1%台盼蓝染色检测细胞活力(应〉90%),再用同样培养液将细胞配成1×106~2×106/ml。 2)分离大颗粒淋巴细胞 1.配制不连续Percoll梯度:取Percoll原液与10倍浓缩的PBS 以9:1的比例混合,此时溶液为100% Percoll,比重是1.127,毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg。将100% Percoll与含0.75%牛血清蛋白的RPMI-1640培养液混合配成41.1%、45.8%、50.0%和66.6%的Percoll溶液。在41.4%和50.0% Percoll溶液中加一滴0.1%台盼蓝,以便区分个梯度溶液的交界面。 2.在50ml离心管中从下向上依次小心加入66.6%、50.0%、45.8%和41.1%的Percoll溶液各10ml,使分别形成明显的交界面。再小心加水10ml约含5×108PBMC的细胞悬液。水平离心500×g 30分钟。 3.分别收集各交界面的细胞,用RPMI-1640 培养液洗涤细胞3次,每次离心500×g 10分钟。用含2%~5%人AB血清的RPMI-1640培养液将细胞配成适当浓度。LGL的密度较低,主要在41.4%和45.8%的交界面。50%和66.6%交界面细胞主要是T细胞,45.8%和50%交界面细胞是T细胞和LGL的混合物。三个交界面中的细胞都有LAK活性。 3)其它来源的效应细胞 1.无菌摘取胎儿胸腺、胎肝、胎脾或肿瘤的引流淋巴结,置含2%~5%人AB血清的RPMI-1640培养液的平皿中。 2.在无菌操作下,用注射器芯将上述器官挤压通过200目的钢丝网,得到单个细胞。用上述培养液洗涤细胞一次。 3.将细胞悬浮于上述培养液中,计数细胞,用台盼蓝染色检测细胞活力(应〉80%),再用同样培养液将细胞配成1×106~2×106/ml。 4)LAK细胞的诱生和扩增 1.向上述各种来源的淋巴细胞悬液中加重组IL-2到1000U/ml。以2×106/ml的细胞浓度,在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3~5天,细胞即具有LAK活性。 2.培养3~5天的LAK细胞数量基本没有变化。如需较多的LAK细胞,可以继续培养至2~3周:每当细胞生长到5×106~10×106/ml时分瓶,用同样培养液将细胞配成1×106~2×106/ml,再加IL-2继续培养。
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