陈建忠

(诸暨市红十字医院,浙江诸暨311800)

[摘要]综合介绍DNA 测序中常用毛细管凝胶电泳(C GE) 分离技术。着重分析了C GE 生物大分子(例如DNA) 分离原理、

优点以及影响分离结果的主要因素。从理论上对影响分离的因素作出调控优化的论述。

[关键词]DNA 测序;C GE 分离技术;分辩率

[中图分类号]R319 [文献标识码]A [文章编号]1007 - 7510(2005) 01 - 0042 - 02

The ca pillary gel electrophoresis techn ique in D NA sequence determina t ion

CHEN J ia n - zho ng

(Zhejia ng Zhuji Red Cro ss Ho spit al ,Zhuji Zhejia ng 311800 ,China)

Abstract : The C GE sepa rat io n t echnique usually used in DNA Seque nce Det e rminat io n i s int ro duced in det ail in t hi s pape r . The p rinciple of sep a rat ing big biological nume rato r (fo r e xample DNA) by C GE , adva nt age s of C GE a nd key facto r s influe ncing re sult s of C GE sepa rat io n have bee n mainly a nalysed. The op t imizat io n a nd co nt rol abo ut influe nt ialf acto r s a re di scussed in t heo ry.

Key words : DNA seque nce det e rminat io n ;C GE sepa rat io n t echnique ; re solut io n DNA 核苷酸链序列的测定是分析基因结构和功能, 实现 人类疾病基因诊断的基础, 是人类基因组计划的核心内容。目 前自动测序技术的基本原理为双脱氧链末端终止法。测序过程 为先DNA 模板纯化后进行循环测序反应, 再用毛细管凝胶电 泳(C GE) 分离, 最后测序仪自动检测分析得出序列信号图。 DNA 测序能否成功, 主要取决于DNA 模板质量(纯度、浓度 达标) 、循环测序反应、C GE 分离三个关键程序的调控,而其中 DNA 模板质量也可通过C GE 分离鉴定, 达到条带清晰、无杂 带无拖尾即可。所以C GE 在DNA 测序中占有重要地位。本文 对DNA 测序中的C GE 技术作分析综述。   DNA 链的C GE 分离常用聚丙烯酰胺作为凝胶, 结合先 进的四色荧光染料标记技术及激光激发荧光在柱检测, 样本的 四种测序反应物(A 、G、C、T) 可同时在一根毛细管(cap) 内电 泳分离, 依据每条区带的荧光不同加以识别读序。这样不但工 作量大大减少, 而且消除了由于不同cap 迁移率差异对结果的 干扰。   1 C GE 原理在电场作用下, 不同组分在介质中因迁移率 不同而分离成独立的区带。C GE 将凝胶电泳对大分子的高分 离率与cap 电泳的快速、微量相结合。在C GE 中,溶质的分依 赖于溶质的净电荷性质和分子体积大小不同, 凝胶显微网格对 经过的组分具有分子筛作用。当带电溶质分子在电泳迁移通过 网格时受到阻碍, 分子体积越大阻力就越大, 迁移越慢。DNA 分子在溶液中以自由伸展螺旋态存在,这类分子的迁移摩擦系数f 与分子量成正比。而其净电荷q 也与分子量成正比, 每增 加一个碱基对,同时增加两个电荷单位。在自由溶液Cap 电泳 中溶质分子迁移率u = q/ f ,DNA 分子的q/ f 不随分子大小而 变,所以不能分离。在高浓度C GE 中链DNA 分子u 反比于其 分子体积大小,能基于其体积不同而被分离。  2 C GE 特点电泳是在极细内径cap 中进行,电阻高,能用 很高的电压电泳而产生的焦耳(J ) 热小。Cap 的表面积与体 积比大, 又能快速有效散热, 这就极大地提高了速度和分离 率。热的不均匀引起对流会导致分离区带展宽混合, 凝胶的应 用进一步压制了对流,改善了分辨率。高效、快速、高分辨率、低 成本以及高分辨率结合荧光检测只需微量进样, 充分体现了 C GE 的优势, 特别是凝胶的网格结构非常适合对DNA 、蛋白 质类大分子的分离, 这类分子因扩散系数(D) 小很难用高效液 相色谱分离。