RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。 2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。 3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。     RPA的缺点是需要同位素标记探针。 一、试剂准备 1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2 O至100μl。 2.    杂交缓冲液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2 O至10ml。 3.    RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2 O至2ml 二、 操作步骤 1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。 （1）设计含T7启动子的PCR引物    由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5 ’ -端要含T7启动子序列:

 

 

        T7 启动子序列为： 5’-TAATACGACTCACTATAGGG

　

    引物设计的其他要求与一般 PCR 引物的设计相同。 PCR 产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度，具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR ，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：

 

上游引物

下游引物 Ⅱ T7 启动子序列

下游引物 Ⅰ

 

 

 

 

 

 

（ 2 ） PCR

   先用上游引物和下游引物 Ⅰ 进行 PCR ，再以 PCR 产物为模板 , 用上游引物和下游引物 Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见 PCR 章节 ) 。

（ 3 ）探针合成标记与纯化

     在 0.5ml 离心管中加入下列试剂：

RNasin （40U/μl）                           0.5μl

 

 

GACU POOL GAC

 

 

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM）      2μl

 

 

[ α -32 P ] UTP(10μCi/μl)                        2.5μl

 

 

DTT (二硫苏糖醇，0.1M)                         1μl

 

 

5 ×转录 buffer                                 2μl

 

 

模板（50ng/μl）                             1μl

 

 

T7 RNA 聚合酶  (15U)                           1μl

 

 

混合后，短暂离心，37O C保温1hr。

 

 

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37O C 15min, 然后75 O C 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

 

 

加入：饱和酚                                50μl

 

 

氯仿                                  50μl

 

 

酵母tRNA（2μg/μl）                  4μl

 

 

DEPC H2 O                              100μl

 

 

  室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心 管中，加入 100 μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入 3 M NaAc 10 μl 、预冷无水乙醇 250 μl，混匀后，-20O C静置30min。4O C离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4O C离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4O C下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。

 

 

2．杂交

 

 

（1）        RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。

 

 

（2）取8μl RNA加入1- 3 μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。

 

 

（2）        80O C保温2min，然后40- 45 O C下杂交12- 18hr。

 

 

3. 消化

 

 

(1) 杂交管于37 O C保温15min，加入RNase消化液，37 O C保温30min。

 

 

(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 O C保温10min。

 

 

(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min 。

 

 

  (4) 转移上层液到另一 0.5离心 管中，加入 10 μl酵母tRNA和 3M NaAc 15 μl，再 加入 200 μl异丙醇，混匀后，置-20O C 30min，4 O C离心,135000g×10min 。

 

 

(5)   弃上清液，室温下挥发乙醇，加入 5-8 μl上样缓冲液溶解沉淀。

 

 

4、电泳与放射自显影

 

 

（1）配制凝胶：(50ml)

 

 

    40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）       6.25 ml

        5 × TBE                                  10ml

        尿素                                      24g

加 H2 O 至 50ml

   溶解后加入 25% 过硫酸胺 50 μl ， TEMED 50 μl， 混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

（ 2 ）预电泳

    以 1 × TBE 为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达 2000v 以上，功率设定为 100w ，温度设为 50 O C。待胶板温度达 50 O C时，暂停电泳，准备加样。

 

 

（3）加样

 

 

    将已溶解在加样缓冲液中的样品80 O C加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。

 

 

（3）        电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上 一张X片 ，盖上暗盒， -70 O C曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。

 

 

 

 

 

三、注意事项

 

 

 

 

 

1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

 

 

2．RNase消化液消化 未杂交的单链 RNA 和探针 RNA ，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行 PCR 时，采取尽量减少错配的措施。

3、 同位素对 RNA 合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。

4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。