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RT-PCR引物的选择
关键词： RT-PCR 引物 选择来源： 互联网
随机引物
适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
Oligo dT
适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。
基因特异性引物
与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
| 原因 | 建议 | |
| 引物 | 引物特异性差 | 重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用 巢式PCR |
| 引物浓度过高 | 适当减少引物浓度 | |
| Mg2+浓度 | Mg2+浓度过高 | 适当降低Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系 列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。 |
| 耐热聚合酶 | 酶量过多 | 以0.5U为间隔适当减少酶量 |
| 退火温度 | 退火温度过低 | 适当提高退火温度或采用二阶段温度法 |
| PCR循环次数 | PCR循环次数过多 | 减少PCR循环次数 |
操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
最后加入反应模板，加入后盖紧反应管
推荐方法
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