实验原理

转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）。

本实验采用CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

实验试剂

1．LB液体培养基 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。

2．LB固体培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

3．0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。

4．氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。

实验设备

1．恒温水浴箱

2．超净工作台

3．高速冷冻离心机

4．恒温摇床

5．恒温箱

6．消毒离心管

7．消毒tips

8．玻璃培养皿 直径90mm

9．玻璃涂布器

10．95%乙醇

11．标记笔

实验材料

1．人Bcl-2重组质粒 它是Eco R Ⅰ单酶切的pBluescriptⅡ KS(-)载体与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA重组而成的，大小为4 861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体。因此用Eco RⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。

2．大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌。

实验步骤

1．细菌感受态细胞的制备

1) 将DH5α菌种划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。

2) 挑取单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。

3) 次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养至约2～3h，待A600 值达到0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴10～15min。

4) 将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。4 000×g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。

5) 加预冷的已过滤除菌的0.1mol/L CaCl2 重悬菌体，置冰浴30min。4 000×g，4℃离心10min，弃培养基。

6) 再加4ml预冷的0.1mol/L CaCl2 ，轻轻重悬菌体，置4℃冰箱12～16h。

2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α

1) 本实验中的DNA重组子为人Bcl-2重组质粒。在无菌条件下按每管取200μl新鲜感受态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中，共2管，分别加入人Bcl-2重组质粒(10ng)和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。

2) 42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以150 r/min速度振摇45min，使细菌复苏。

3) 每管取200μl加至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min，使液体吸收，然后37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。

注意事项

含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌落平板倒置置于4℃保存，于下周进行质粒DNA的制备。