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DD-PCR

关键词： dd-pcr dd pcr来源：互联网

实验试剂

T12G、T12C、T12A、10－mer的随机引物、RT－PCR试剂盒、测序胶、银染系统

实验设备

PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备

实验步骤

1. 总RNA提取(略)

2. 残留DNA的去除

10×DNA酶缓冲液 2ul

RNA酶抑制剂 1ul

无RNA酶的DNase 1u

加DEPC水至 20ul

混匀，37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，0.3V3M乙酸钠，2V无水乙醇沉淀，冷冻干燥

3. RT 5×RT缓冲液 4ul

加DEPC水至 10ul

80℃ 1min 42℃ 5min 再加入

50nMMgCl₂ 1.3ul

RNA酶抑制剂(40u/ul) 1ul

MMLV(200u/ul) 1ul

加DEPC水至 20ul

37℃ 1小时， 90℃ 1min

4. PCR 上述RT液 4ul

10×PCR缓冲液 1ul

25mM MgCl₂ 1ul 94℃ 1min

10mMdNTP 0.4ul 94℃ 30’

dT12M 0.2ul 40℃ 30’ 40循环

10mer随机引物 0.2ul 72℃ 45’

水 3.9ul 72℃ 6min

Taq酶（5u/ul） 0.1ul

混匀后，离心，再加上10ul石蜡油，按右边参数扩增。

5. 检测龈染检测(略)

6. 差异带切割、回收操作(略)

7. 回收差异带二次扩增

回收的差异带稀释 50－100倍

10×PCR缓冲液 1ul

25mM MgCl₂ 1ul 94℃ 1min 94℃ 45’

10mMdNTP 0.4ul 94℃ 45’ 42℃ 45’

dT12M 0.2ul 40℃ 45’ 72℃ 60’

10mer随机引物 0.2ul 72℃ 60’ 20循环

加水至 10ul 20循环 72℃ 6min

Taq酶（5u/ul） 0.1ul

8. PCR片断的再回收和克窿操作(略)

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