实验试剂

1. RPMI-1640

2.Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、DNA酶

3. 0.001％的透明质酸酶和DNA酶

4. IL-2

实验设备

80目和200目不锈钢网

实验材料

肿瘤组织

实验步骤

1. 无菌切取肿瘤组织或肿瘤浸润的局部淋巴结，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中；

2. 将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10～20ml，同时加入0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001％的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4～6h；

3. 依次用80目和200目不锈钢网过滤；

4. 经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1500rmin离心5～10min；

5. 用含5％NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100％淋巴细胞分层液加入试管底层，其上缓慢加入75％的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)然后缓慢加入上述肿瘤细胞悬液3～5ml；

6. 经1500～1800r/min离心20min后，分别收集75％和100％淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞；

7. 用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5～10min。肿瘤细胞加入冻存液后液氮冻存备用。TIL则用含20％NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5×106 /ml；

8. 将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1ml/孔)，同时分别加入IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb 1μg/ml，置37℃，5％CO2 温箱培养3～4周，其间3～5 d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。