作者

Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1

1U. S. Food and Dru g Administration, Center for Veterinary Medicine,Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. 2U.S. Food and Dru g Administration, Center for Dru g Evaluation andResearch, Office of Compliance, Silver Sprin g, MD 20993, USA. 3Nebraska Department of A griculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln,Nebraska 68508, USA.

摘要

我们开发了一种检测猪源肝素钠粗品中的反刍动物源污染的实时荧光定量PCR技术。该检测法由一套针对反刍动物（牛、绵羊、山羊）和猪的冻干引物、探针及扩增内标组成。该方法经过两处分析机构验证：第一个位于FDA，第二个位于某州独立实验室。

肝素钠多重实时荧光定量PCR（hMRTA）检测方法性能通过了美国FDA兽药中心研发处制定的特异性、灵敏度和专一性严格验收标准。符合早前建立的饲料中反刍动物原料多重实时荧光定量PCR检测法的灵敏度和重复性要求。

hMRTA法检测猪源肝素钠粗品，98%达灵敏度，真阳性98%、假阴性2%。PCR检测法检测三个反刍动物物种，可作为判定猪属来源的初步筛选、复查确认工具。进一步保证肝素钠粗品质量，帮助识别控制肝素钠生产来源物种。对粗品肝素钠来源的控制对确保含肝素钠药物和耗材的安全性以及保护公众健康至关重要。

引言

FDA的工业指南草案《药物及医疗设备用途肝素：粗品肝素质量监管》（Heparin for Dru g and Medical DeviceUse: Monitorin g Crude Heparin for Quality）就粗品肝素污染的可能风险对活性药物成分（APIs）制造商、药物和医疗设备的成品制造商、分装商及其他相关方进行了警告。

该指南草案提供了数个推荐项目，它们将帮助API制造商、药物及医疗设备成品制造商、分装商及其他相关方更好地控制可能含有过硫酸软骨素（OSCS）或非猪原料（特别是反刍原料）污染的粗品肝素的使用。

除其他事项外，该草案推荐，接收和使用粗品肝素来生产药物和医疗设备的生产商或医疗设备制造商，在制造含肝素的药物或医疗设备前，应检测并确认每批粗品肝素的动物来源。

检测方法应当通过资格认证，且应基于良好的科学原则（例如足够的准确性的特异性），拥有与当前科学认知和评估状况相称的灵敏性。以下是一种使用实时聚合酶链式反应（PCR，hMRTA）测定粗品肝素中反刍动物污染物的分析方法。

此法已使用猪源粗品肝素和牛标准物进行了适应性评估。可用于鉴别猪源粗品肝素中的反刍DNA。本草案提供了RT-PCR法检测猪粗品肝素中反刍原料的详细方法、所需试剂和设备。其他合适的替代方法也可进行资格验证，以用于检测粗品肝素中的反刍原料。

材料及方法

建议每批待测样品（提取、纯化和PCR）都设立阴性对照。并同时给每批Bio gX Ruminant and Porcine Beads设置商业化基因组DNA（牛、猪、山羊、绵羊）阳性对照。

1. DNA提取

介绍:

下面是从0.5 ml干燥粗品肝素中提取DNA的方法说明。请在提取操作开始前通读整篇标准操作流程。本方法使用了Invitro gen(Carlsbad, CA)生产的Char geSwitch® gDNA Rendered Meat PurificationKit。

所有的试剂、枪头和离心管均为DNase free。枪头需有气溶胶抗性（Aerosol resistant），减少从DNA提取到PCR扩增过程中样品之间的交叉污染。因处理的是粉状物质，建议步骤1、2带上口罩，并与DNA提取、纯化和PCR地点隔离。

注意：粗品肝素钠的 PCR 检测需在其它会影响 DNA 完整性的任何前处理（如化学氧化）前进行，以免影响 PCR 物种检测结果。

1.1. 所需材料：

试剂盒：

Char geSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)

PowerClean® DNA Clean-Up Kit (MOBIO Product# 12877-50)

Bio gX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)

设备要求:

Micro centrifu ge

Heat Block

Nuclease Free Water

Vortex

Invitro gen Ma gna Rack

2.0 ml Tubes

Smart-Cycler

Smart Cycler centrifu ge

Smart Cycler coolin g block

SmartCycler 25 μL reaction tubes

1.2. 操作步骤

a. 加入混匀的肝素钠样品到2 ml离心管的0.5 ml标记线。

*关键步骤：每次只加一个样，前一个样品加样完成前不能打开下一个离心管。

b. 加入1 ml Char geSwitch Lysis Buffer到样品中。往离心管加入裂解缓冲液时，离心管稍微倾斜。

c. 每样加入100 μL Char geSwitch SDS。涡旋5s混匀。

d. 95 ℃孵育（水浴或加热箱）5 min。

e. 每样加入400 μL Char geSwitch Precipitation Buffer（N5）。涡旋5 s混匀。

f. 冰浴离心管5 min沉淀蛋白。

g. 室温16100 g离心5 min。

h. 转移1200 μL上清液到一个新的离心管中。

i. 涡旋装有Char geSwitch Ma gnetic Beads的离心管，充分重悬浸泡在储存缓冲液中的磁珠。

j. 加入200 μL Char geSwitch Deter gent到含上清液的离心管中。

k. 加入40 μL充分重悬的Char geSwitch Ma gnetic Beads。

l. 上下吹打5次混匀。

m. 室温孵育1min。

n. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。

o. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。

p. 从磁铁取下离心管。

q. 加入1 ml Char geSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。

r. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。

s. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。

t. 从磁铁取下离心管。

u. 加入750 μL Char geSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。

v. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。

w. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。

x. 加入750 μL Char geSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。

y. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。

z. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。最后一次清洗，吸掉所有上清。

aa. 从磁铁取下离心管，此时管内不应有上清液。

bb. 加入75 μL Char geSwitch Elution Buffer（E5）到离心管。

cc. 轻轻上下吹打10次重悬Char geSwitch Ma gnetic Beads。

dd. 室温孵育1 min。

ee. 把离心管放到Ma gnaRack上直至Char geSwitch Ma gnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约1 min）。

ff. 离心管留在磁铁上，小心转移含有DNA的上清到一个新的灭菌了的2 ml离心管中，勿搅动沉淀。吸取上清时，枪头不要对着沉淀。

g g. 弃去用过了的Char geSwitch Ma gnetic Beads。

*DNA -20 ℃冷冻保存或继续进行DNA纯化去杂质