一、材料 1. 无菌 (1)L-15 Leibovitz 培养液 (2)Ham F12 培养液或 WilliamE 培养液:80~100 ml,含有 0.2% 牛白蛋白(V 级,Sigma) 和 1 ug/ml 牛胰岛素
(3)胞培养液(hepatocyte minimalmediu,HMM ):67.5% EMEM 和 22.5%199 培养液,或用
William E 培养液代替这两种培养液。添加 5ug/ml 牛胰岛素、lmg/ml BSA、20 mmol/L 丙酮酸钠、100U/ml
青霉素、100 Mg/ml 链霉素和 20%FBS (4)HMM/SF:无血清 HMM ,添加 10-5mol/L 氢化可的松半琥珀酸酯 (5)无钙 HEPES 缓冲液:含有 160.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl、0.7 mmol/L Na2 HPO4·12 H2O 和 33 mmol/L HEPES,pH 7.65。用 0.22, 又微孔滤器过滤除菌,在 4℃ 条件下储存,可存放 2 个月 (6)胶原蛋白酶液:含有 0.025% 胶原蛋白酶(I 级,Sigma; 或 Boche,103578) 和 0.075% CaCl2·2 H2O,用 pH 7.65 的无钙 HEPES 缓冲液配制。使用前配制,并用滤器过滤除菌 (7)5% 戊巴比妥钠(Abbott) (8)肝素(Roche) (9)聚乙稀管:内径为 3 mm ,外径 5 mm (10)一次性 20 G 头皮静脉输液针(Dubernard Hospital Laboratory,Bordeaux,France) (11)插管用的缝合线 (12)刻度瓶和 Petri 培养皿 (13)手术器械:尖剪、直剪、弯剪和手术夹 (14)2 支二次性 1 ml 注射器 2. 非灭菌 (1)计时器 (2)蝠动泵:10~200r/min (3)水浴箱 二、操作步骤 1. 用水浴箱将 HEPES 缓冲洗液和胶原蛋白酶液预热,一般 38~39℃,进人肝内时为 37℃。不需要加氧。 2. 将螺动架的流速设定在 30 ml/min。 3. 腹膜腔注射戊巴比妥钠(每 100 g 体重注射 150ul),将大鼠(180~200 g ) 麻醉。然后,经股静脉注射 10001U 肝索。 4. 用 70% 乙醇擦洗大鼠腹侧面。 5. 切开腹壁,在离肝约 5 mm 处将结扎线系于肝门静脉上。朝肝的方向插管后,结扎肝门静脉。 6. 为了避免压力过高,迅速剪开肝静脉。以流速 30 ml/min 灌注 500 ml 无钙 HEPES 缓冲液。几秒钟内确认肝变白。 7. 以流速 15 ml/min 灌注 300 ml 胶原蛋白酶液。肝变得肿胀。 8. 切除肝,用 HEPES 缓冲液冲洗。 9. 剥离 Glisson 囊后,用 100 ml L-15 Leibovitz 培养液分散细胞。 10. 用两层纱布或孔径为 60~80um 的尼龙网过滤细胞悬液。通常在室温条件下,让有活力的细胞沉淀 20 min 。然后,吸去 60 ml 含有细胞碎片和死细胞的上清液。 11. 通过缓慢离心(50 g,40s) 洗细胞 3 次,以除去胶原蛋白酶、损伤细胞和非实质性细胞。 12. 用 HMM 混悬分离的肝细胞。 13.2~3 h 后,活细胞会贴壁,并开始伸展。吸去含有死细胞的上清液。 14. 细胞贴壁后,用 HMM/SF 替代含有 FBS 的 HMM。此后,每天换培养液。
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