大鼠星型胶质细胞培养实验
酶消化法
胰酶消化法
胰蛋白酶消化法
| 实验方法原理 | 大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧D-Hanks'液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。 |
|---|---|
| 实验材料 | Wistar大鼠乳鼠 |
| 试剂、试剂盒 | FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精 |
| 仪器、耗材 | 眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 |
| 实验步骤 |
一、实验步骤
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死。
2. 取脑放入冷的D-Hanks'平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。
3. 分离两侧大脑皮质并剪成1mm3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培养基终止消化，离心(1 000 rpm，10 min)，去上清。
5. 用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，经75μm筛网过滤，收集滤液，再次离心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5x106/ml，种植于75 cm2 培养瓶。
6. 经1 小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75 cm2 培养瓶继续培养，两天换液一次。
7. 7 天后将培养瓶放入水平摇床(260 rpm，2 h，37℃)，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1 小时，重新置于水平摇床18 h。
8. 换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA 1:1 混合液消化、传代备用。
二、 形态学观察
三、 细胞生长曲线绘制
四、星型胶质细胞的鉴定 五、结果 图1：星型胶质细胞形成融合状，单层生长(x200) 2. 鉴定：细胞经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均为细胞浆着色，而胞核未见着色，见下图，证明采用上述方法获得的细胞为星型胶质细胞，纯度高， 可用于实验。
图2：免疫组化鉴定，GFAP 染色
图3：细胞生长曲线
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