MALDI-TOF MS在中段尿样本细菌直接检测中的应用
引言
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近些年发展起来的一种新型的细菌鉴定技术。它主要根据不同细菌具有不同的蛋白质指纹图谱, 通过Biotyper鉴定系统将获得的蛋白质指纹图谱与数据库中已知的各菌种的标准图谱进行比对, 从而完成对各种微生物的鉴定。该方法无需进行常规的革兰染色、氧化酶、触酶、生化反应, 仅在几分钟之内就可完成鉴定比对, 操作简便、快速、高通量、低耗材成本。目前MALDI-TOF MS主要应用于对经培养的单个菌落的鉴定, 它能够快速准确地鉴定临床常见细菌和真菌, 被认为是最有效率的鉴定方法之一。
MALDI-TOF MS应用于临床样本的直接检测也越来越受到重视。国外已有商品化试剂盒Sepsityper配合MALDI-TOF MS直接用于检测阳性血培养瓶中的细菌, 无需18~24 h的转种培养过程, 显著缩短细菌鉴定时间, 对于临床血流感染患者及早准确用药有着重要意义。而MALDI-TOF MS在其它体液样本(包括尿液)细菌鉴定中的应用报道较少, 本研究旨在应用MALDI-TOF MS快速直接检测中段尿样本中的细菌, 以建立合适的方法便于临床推广应用。
材料和方法
一、样本来源
尿液样本为2014年8至9月浙江大学医学院附属第二医院门诊及住院患者无菌采集的中段尿样本, 共692例, 患者男339例, 女353例, 年龄(42.0± 1.3)岁。
二、试剂和仪器
Microflex LT MS仪购自德国布鲁克-道尔顿公司; MALDI-TOF MS所用试剂包括三氟乙酸、α -氰-4-羟基本丙烯酸、色谱级乙腈、甲酸和无水乙醇均购自美国Sigma公司。Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪(简称Vitek 2 Compact)及其配套的细菌鉴定卡购自法国生物梅里埃公司。哥伦比亚血平板、中国蓝平板购自杭州威晟生物科技公司。MALDI-TOF MS校准株为大肠埃希菌DH5α 。Vitek 2 Compact质控菌株为阴沟肠杆菌(ATCC 700323)和铅黄肠球菌(ATCC 700327)。
三、方法
1. 尿液样本的常规培养和鉴定
用定量接种环将中段尿样本接种于哥伦比亚血平板、中国蓝平板, 37 ℃ 5%CO2孵箱中培养18~24 h。待菌落形成后挑取单个菌落均匀涂布于MALDI-TOF MS专用不锈钢基质靶板上, 进行MALDI-TOF MS快速鉴定。同时按照其操作指南挑取单个菌落制备一定浊度的菌悬液于Vitek 2 Compact上机鉴定。
2. 尿液样本质谱分析前处理
吸取6 mL尿液样本于无菌离心管中, 2 000× g离心4 min去除蛋白。离心完毕后尽可能小心地取出离心管, 将上清液转移至另一无菌离心管中, 在20 ℃下12 000× g离心5 min。弃上清, 在沉淀中加入1 mL 0.45%无菌生理盐水, 充分震荡混匀后12 000× g离心5 min。弃上清, 用1 mL去离子水洗涤沉淀, 同样转速和时间离心弃上清液。用加样器吸取1 μ L沉淀均匀涂布于96孔靶板上, 自然干燥待用。
3.MALDI-TOF MS分析
靶板上的每个已点样的靶点覆盖1 μ L基质液(50%乙腈+2.5%三氟乙酸配制的饱和α -氰基-4-羟基肉桂酸溶液)。大肠埃希菌DH5α 的蛋白抽提液作为蛋白校准品, 测定时用于仪器的校准和阳性对照。样本干燥后将靶板放入MALDI-TOF MS仪检测。仪器参数设置为正线性操作模式, MALDI-TOF MS收集的质量范围为2 000~20 000, 加速电压为20 kV, 提取电压为18.6 kV, 聚焦电压为6.5 kV, 提取延迟时间为150 ns。每次实验前都要在采集数据的质量范围内(2 000~20 000)用校准肽蛋白进行质量校正, 校正完毕后方可进行质谱图数据的采集, 图谱采集使用Flex Control 3.0软件, 图谱数据比对使用Bruker Biotyper 3.0软件与标准数据库进行比对, 使用分值量化和判定结果, 评分> 2.0可鉴定到种的水平, 评分< 2.0而> 1.7可鉴定到属的水平, 评分< 1.7则表示无法给出可靠的鉴定结果。
结果
一、菌落MALDI-TOF MS鉴定与Vitek 2 Compact鉴定结果的比较
692例中段尿样本中, 98例只培养到1种细菌且细菌数量> 104 CFU/mL, 菌落MALDI-TOF MS鉴定结果与Vitek 2 Compact上机鉴定结果一致。
二、单一菌感染的中段尿样本MALDI-TOF MS直接检测与菌落MALDI-TOF MS鉴定结果的比较
本研究中MALDI-TOF MS直接检测尿液所得评分> 1.7即认为检出, 尿液直接MALDI-TOF MS分析得到74个阳性结果, 总检出率为75.5%, 具体检出情况见表1。尿培养结果表明, 革兰阴性菌为尿路感染主要致病菌, 占76.5%, 其中大肠埃希菌最为常见(占50.0%), 肺炎克雷伯菌次之(占15.3%); 革兰阳性菌相对较为少见, 仅见粪肠球菌(占23.5%)。与培养结果比较, MALDI-TOF MS对不同菌种的检出情况有所差异, 粪肠球菌、摩根摩根菌、弗劳地枸橼酸杆菌和克氏枸橼酸杆菌检出率较高(100.0%), 肺炎克雷伯菌次之(86.7%), 继而是大肠埃希菌(79.6%)、鲍曼不动杆菌(50.0%)和阴沟肠杆菌(50.0%)。
三、混合菌感染的中段尿样本MALDI-TOF MS直接检测与菌落MALDI-TOF MS鉴定结果的比较
64例尿液样本培养到2种细菌, 而MALDI-TOF MS直接从44例尿液样本中检出优势生长菌(> 104 CFU/mL), 非优势菌主要为表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、无乳链球菌、棒状杆菌、恶臭假单胞菌等常见的污染菌, 具体检出情况见表2。混合感染样本中大肠埃希菌最为常见, 共检出25株, 占混合感染样本中所有检出菌株的56.8%。
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讨论
临床微生物实验室中, MALDI-TOF MS在单菌落鉴定上的应用因其独特的优势— — 快速、准确、操作简便而迅速得到推广。对于临床常见菌, MALDI-TOF MS可将84.1%~93.6%的细菌准确鉴定至菌种水平。至于临床难培养的细菌, MALDI-TOF MS更展现出常规生化反应方法无法企及的优势。SCHMITT等报道MALDI-TOF MS可将70.8%的厌氧菌准确鉴定到种, 91.7%准确鉴定到属。随着数据库的不断扩充, MALDI-TOF MS对军团菌、分枝杆菌等苛养菌和缓生菌的鉴定能力越来越强。近年来, MALDI-TOF MS开始被应用于细菌耐药性研究, 主要用于检测革兰阴性杆菌中的β -内酰胺酶尤其是碳青霉烯酶。我们成功应用MALDI-TOF MS检测肠杆菌科细菌KPC-2型碳青霉烯酶和克雷伯菌属细菌中外膜蛋白OmpK36的缺失。
MALDI-TOF MS对体液样本细菌的直接检测逐渐开始应用, 主要为血培养和尿液样本。国外学者应用MALDI-TOF MS直接检测尿液细菌主要关注菌量> 105 CFU/mL的样本, FERREIRA等报道MALDI-TOF MS直接检测尿液样本在菌种水平准确率为91.8%, 而菌属水平准确率为92.7%。本次研究应用MALDI-TOF MS对菌量> 104 CFU/mL的尿液样本进行检测, 总的检出率为75.5%。世界卫生组织推荐抗菌药物使用比例不超过30%, 而在中国50.3%的门诊患者接受抗菌药物治疗。患者在尿培养之前接受经验性的抗菌药物治疗可显著影响尿培养结果。不足量或不正确的抗菌治疗可在一定程度抑制细菌在培养基上的生长, 使得尿培养菌落计数偏少。此外, 尿培养结果报告革兰阴性菌菌量在104 CFU/mL数量级, 对临床尿路感染的诊断有一定的意义。而MALDI-TOF MS对菌量< 104 CFU/mL的尿液样本的检测随着菌量的减少峰图信号愈差, 检测能力降低。因此, 本次研究关注菌量> 104 CFU/mL的尿液样本。MALDI-TOF MS直接检测法与菌落MALDI-TOF MS鉴定存在差异, 可能受以下2个因素影响:(1)MALDI-TOF MS直接检测的尿液样本经离心处理, 菌与蛋白混于沉淀中且分布不均, 从而导致质谱信号不好; (2)尿液未经过培养增菌, 菌量少, 信号差, 甚至有的样本菌量低于检出限而导致MALDI-TOF MS检测不出, 这可能是影响MALDI-TOF MS直接检测尿液样本细菌的主要因素。
在检测单一菌种的样本时, MALDI-TOF MS对同一菌种的不同样本检测结果各不相同。如49例大肠埃希菌阳性的尿样本, 26例直接检测评分> 2.0, 而13例评分介于1.7~2.0之间, 1例评分< 1.7, 剩余9例无图谱。造成这一现象最主要的原因是菌量多少不一, 菌量多的峰图信号好, 因而检测结果可靠, 分值高; 而菌量少的峰图信号不好, 检测结果不好, 准确性不高, 至于未检出的则可能是菌量过少, 低于检出限, 且蛋白等杂质干扰掩盖检测信号。因此, 必须完善质谱前处理流程, 以尽量去除蛋白, 富集细菌, 提高检出率。
WANG等研究发现尿液样本中2种菌以1∶ 1或1∶ 2混合时, MALDI-TOF MS直接检测时能够同时检测到2种菌, 而当两者以1∶ 9比例混合时, 只有优势菌能够被检出。而在本研究中, MALDI-TOF MS检测混合菌感染的尿液样本时, 同一样本中的多种细菌计数在同一数量级时可互相干扰MALDI-TOF MS峰图导致无法鉴定; 当非优势菌数量比优势菌低一个数量级, 且非优势菌为表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、无乳链球菌、棒状杆菌、恶臭假单胞菌等可疑污染菌时, 优势菌的MALDI-TOF MS峰图受非优势菌的干扰较少, 甚至几乎不受干扰。
尿路感染是人类最常见的感染之一, 据文献报道门诊患者中大于80%的尿路感染是由大肠埃希菌引起, 而导管相关性尿路感染是最常见的医院性感染, 大多由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等所致。社区获得性尿路感染同样以大肠埃希菌最为常见, 由于中段尿培养需要时间长、费用高, 所以临床治疗尿路感染多以经验治疗为主。临床上尿液样本中细菌的鉴定常规方法从培养到鉴定需要36~48 h, 应用MALDI-TOF MS仪只需简单前处理可直接检测, 可在2 h内完成菌种鉴定, 比尿培养加MALDI-TOF MS菌落鉴定提前平均20 h, 而比常规的尿培养加Vitek 2 Compact上机鉴定提前平均34~46 h。应用这种快速方法, 可省去耗时的培养过程, 临床医生可以提前42 h结合患者症状对患者进行诊断并针对病原菌予以合适的抗菌治疗, 提高有效治愈率。MALDI-TOF MS直接检测方法还可克服尿培养结果受前期经验性用药影响的缺陷, 帮助临床医生及时更改治疗方案, 减少经验性用药, 防止耐药菌的产生。MALDI-TOF MS对于混合菌感染的中段尿样本的检测更是凸显一定的优势, MALDI-TOF MS可报告优势菌, 省去分离纯培养的时间, 相比常规方法可提早46~64 h。毋庸置疑, MALDI-TOF MS直接检测尿液样本中的细菌是对基于培养的传统方法的革命性创举。虽然目前要获得药物敏感性试验结果仍然需要对尿液样本进行培养和常规的药物敏感性试验, 但MALDI-TOF MS在检测超广谱β -内酰胺酶、碳青霉烯酶方面已有应用[8], 假以时日, MALDI-TOF MS将细菌鉴定和药物敏感性联合直接检测尿液样本, 将为尿培养细菌的鉴定和药物敏感性提供更快捷、更准确的途径。
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