色谱法概述（二）
第七课 液相色谱仪
气相色谱法是一种很好的分离、分析方法，它具有分析 速度快、分离效能好和灵 敏度高等优点。但是气相色 谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质。据估 计，在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物 约占15％，加上制成衍生物的化合物，也不过20％左右。 对于高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物、离子 型化合物及高聚物等，很难用气相色谱法分析。为解决 这个问题，70年代初发展了高效液相色谱。高效液相色 谱的原理与经典液相色谱相同，但是它采用了高效色谱 拄、高压泵和高灵敏度检测器。因此，高效液相色谱的 分离效率、分析速度和灵敏度大大提高。 就其分离机 理的不同，高效液相色谱可以分为液－固吸附色谱、 液－液分配色谱、 离子交换色谱和凝胶渗透色谱四类。 液—固色谱的色谱柱内填充固体吸附剂，由于不同组分 具有不同的吸附能力，因此， 流动相带着被测组分经 过色谱柱时，各组分被分开。 液—液色谱的流动相和 固定相都是液体。作为固定相的液体涂在惰性担体上， 流动 相与固定液不互溶。当带有被测组分的流动相进 入色谱柱时，组分在两相间很快达分配平衡，由于各 组分在两相间分配系数不同而彼此分离。以非极性溶 液作流动相，极性物质作固定相的液—液色谱叫正相 色谱；极性溶液作流动相，非极性物质作固定相的液 —液色谱叫反相色谱。 离子交换色谱的色谱柱内填充 离子交换树脂，依靠样品离子交换能力的差别实现分 离。而凝胶色谱是按试样中分子大小的不同来进行分 离的。 在上述四类色谱中，应用最广泛的是液—液色 谱，因此，在本节的讨论中以液—液 色谱为主。 高 效液相色谱的基本理论和定性定量分析方法与气相色谱基本相同。高效液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。
第八课 液相色谱仪－输液系统
输液系统 高效液相色谱的输液系统包括流动相贮存器、高压泵和梯度淋洗装置。流动相贮存器为不锈钢或玻璃制成的容器，可以贮存不同的流动相。高压泵是高效液相色谱仪最重要的部件之一。由于高效液相色谱仪所用色谱柱直径细，固定相粒度小，流动相阻力大，因此，必须借助于高压泵使流动相以较快的速度流过色谱这。高压泵需要满足以下条件：能提供150－450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；耐腐蚀。目前所用的高压泵有机械泵和气动放大泵两种。梯度淋洗装置可以将两种或两种以上的不同极性溶剂， 一定程序连续改变组成，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。它的作用与气相色谱中的程序升温装置类似。
梯度淋洗装置分为两类：一类叫外梯度装置；一类内梯度装置。外梯度装置是流动相在常压下混合，靠一台高压泵压至色谱柱；内梯度装置是先将溶剂分别增压后，再由泵按程序压入混合室，再注入色谱柱。
第九课 液相色谱仪－
进样系统，分离系统进样系统一般高效液相色谱多采用六通阀进样。先由注射器将样 品常压下注入样品环。然后 切换阀门到进样位置，由高压泵输送的流动相将样品送人色谱柱。样品环的容积是固定的，因此进样重复性好。
分离系统 分离系统包括色谱柱、连接管、恒温器等。色谱柱是高效液相色谱仪的心脏。它是 由内部抛光的不锈钢管制成，一般长10—50cm，内径2—5mm，柱内装有固定相。液相色谱的固定相是将固定该涂在担体上而成。担体有两类：一类是表面多孔型担体；另一类是全多孔型担体。
近年来又出现了全多孔型微粒担体。这种担体检度为5—10 um，是由nm级的硅胶微粒堆积而成，又叫堆积硅珠。由于颗粒小，所以柱效高，是目前最广泛使用的一种担体。 在高效液相色谱分析中，适当提高柱温可改善传质，提高桂效，缩短分析时间。因 此，在分析时可以采用带有恒温加热系统的金属夹套来保持色谱拄的温度。温度可以在室温到60℃间调节。
第十课 液相色谱仪－检测系统
检测系统 高效液相色谱的检测器很多，最常用的有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。
(1)紫外检测器
紫外检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，适用有紫外吸收物质的检测。在进 行高效液相色谱分析的样品中，约有80％的样品可以使用这种检测器。紫外检测器的工作原理如下：由光源产生波长连续可调的紫外光或可见光，经过透镜和遮光板变成两束平行光，无样品通过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信号产生；有样品通过时，由于样品对光的吸收，参比池和样品池通过的光强度不相等，有信号产生。根据朗伯—比尔定律，样品浓度越大，产生的信号越大， 这种检测器灵敏度高，检测下限约为 10(-10) g／ml，而且线性范围广，对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱。
(2)示差折光检测器
示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的。凡是具有与流动 相折射率不同的组分，均可以使用这种 检测器。如果流动相选择适当，可以检测所有的样品组分。示差折光检测器分为反射式和沂射式两种。反射式示差折光检测器是根据下述原理制成的：光在两种不同物质界面的反射百分率与入射角和两种物质的折射率成正比。如果入射角固定，光线反射百分率仅与这两种物质的沂射率成正比。光通过仅有流动相的参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的；光通过工作池时，由于存在待测组分而使折射串改变，从而引起光强度的变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。偏转式示差折光检测器是根据下述原理：当一束光透过折射率不同的两种物质时，此光束会发生一定程度的偏转，其偏转程度正比于两物质折射率之差。 示差折光检测器的优点是通用性强，操作简便；缺点是灵敏度低，最小检出限约为 10(-7)g/ml ，不能做痕量分析。此外，由于洗脱液组成的变化会使折射率变化很大，因此，这种检测器也不适用于梯度洗脱。
(3)荧光检测器
物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级 跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较 长的光，这种光称为荧光。在其他条件一定的情况下，荧光强度与物质的浓度成正比。许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使其转化为具有荧光活性的衍生物。在紫外光激发下，荧光活性物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。 荧光检测器是一种选择性检测器，它适合于稠环芳烃、氨基酸、胺类、维生素、蛋 白质等荧光物质的测 定。这种检测器灵敏度非常高，其检出限可达10(-12)_10 (-13)g/ml，比紫外检测器高2—3个数量级，适合于痕量分析 。而且可以用于梯度洗脱。其缺点是适用范围有一定的局限性。
